导读

荧光干扰是制约拉曼光谱技术发展的关键问题之一，其对光谱分析会产生显著的负面影响。由于拉曼信号和荧光信号同属光致发光现象，且光谱波长范围存在重叠，而荧光信号强度通常比拉曼信号强数个数量级，这使得荧光干扰问题尤为突出。当样品或环境中存在荧光物质时，这些物质在激光激发下会产生强烈的荧光信号，导致拉曼光谱背景基线显著抬升，甚至完全淹没拉曼特征峰，使拉曼信号难以有效识别。时间门控拉曼光谱技术是区分微弱拉曼信号与强荧光背景的关键工具，但其固有局限为狭窄的光谱覆盖范围和有限的光谱分辨率，这严重阻碍了其在复杂样品分析中的广泛应用，并使其难以同时获取样品的完整化学组分与分子动态信息。

近日，中国科学院长春光机所李备研究员与英国卡迪夫大学Wolfgang Langbein教授团队创新性地开发了时间分辨光子计数傅里叶变换显微拉曼光谱平台。该技术巧妙融合了光子计数的高灵敏度和傅里叶变换光谱的宽谱高分辨优势，成功拓宽了可探测的光谱范围并提升了光谱分辨能力。实验结果有力证实，该仪器不仅能高效分离拉曼与荧光信号，更能同步实现高空间分辨率的拉曼与荧光寿命成像。相关研究成果以“Time-resolved photon counting Fourier-transform micro-spectroscopy enables simultaneous Raman and fluorescence lifetime imaging”为题发表于Light: Science & Applications。论文通讯作者为李备研究员、Wolfgang Langbein教授，第一作者为尚林东博士。

拉曼光谱是材料科学、半导体工业、环境测试、考古学和生物医学的重要工具。但其应用的一个重要限制是荧光背景，它可能会淹没拉曼光谱信号。大多数拉曼光谱使用连续激光器激发信号，因此无法根据拉曼和荧光成分的时间动力学来分离拉曼和荧光成分（拉曼信号是瞬时的，荧光的典型寿命在纳秒范围内）。通常的做法是从测量的拉曼光谱中拟合光谱中的荧光宽背景，以消除荧光。然而这种做法会将部分拉曼信号一并扣除，会影响拉曼光谱的分析识别。为了真正实现荧光抑制这一问题，需要使用时间门控拉曼技术。目前，光栅式时间门控技术已有成功案例，但由于单光子雪崩二极管（SPAD）技术瓶颈，难以同时满足高光谱分辨率、宽光谱范围和高时间分辨率的需求。

本文提出了一种基于高分辨率傅里叶变换光谱仪和SPAD的时间门控拉曼系统。研究团队设计了一个光子矩阵来存储SPAD检测到的光子事件，并开发了一种策略来校正所获得的光子矩阵干涉曲线，以获得高信噪比的时间分辨拉曼光谱。

图1：傅里叶时间门控拉曼光谱仪光路图

研究团队采用马赫曾德尔干涉仪结合高精度直线电机位移台，并与单光子雪崩二极管、单光子计数器时间标记采集配合使用（图1），允许将光子事件按照发生绝对时间和相对时间顺序放置在光子矩阵中（图2a，b）。该矩阵横轴叠加为干涉强度曲线，纵轴叠加为荧光寿命曲线（图2c）。

图2. (a) 记录到光子事件的相对和绝对时间； (b) 记录光子事件的数据矩阵； (c) 测量数据矩阵值。将光子数据矩阵的行相加可获得干涉曲线, 而列相加可获得光子强度曲线。(聚苯乙烯 (PS) 片, vf= 0.25 mm/s，Tf= 1 s，Nf=10)

在傅里叶式干涉系统中，位移台的校准一直是一个核心问题，由于本工作使用波长532 nm的脉冲激光，相比传统傅立叶式使用1064 nm激光对位移台校正精度要求更高，再加上本工作使用四倍光程差设计，使位移台的移动错误放大了四倍，所以校正难度进一步增大。为了解决这些问题，本工作使用位置同步输出（PSO）结合单模激光干涉相位拟合的方式对位移台进行位置校正。从结果图中可以看出经过位置校正后激光谱线信噪比有了极大提升（图3）。

图3：高精度位移台校正过程图。 (a) 位置同步输出pso校正过程图(pso插值间隔为25 nm)。 (b) 单模激光干涉和余弦相位拟合图。 (c) pso和相位拟合细节差别图。 (d) 25组细节差别罗列图和均值曲线图。(e, f, g) 单模激光曲线校正过程图(双探测器叠加)

为了确定系统整体时间分辨率和光谱分辨率，研究团队首先使用脉冲激光测试其时间分辨率。从脉冲激光谱线2D、3D热图（图4a，c）中可以看出该仪器实现了547 ps的时间分辨率（图4b）。其次使用连续激光测试系统最大光谱分辨率，从图中可以看到系统最大可实现的光谱分辨率为0.05 cm^-1（图4d，e）。

图4：(a) 使用 Pl= 2.5 mW，vf= 0.25 mm/s，Tf= 1 s，和 Nf= 20 记录脉冲激发激光器的谱线信号，显示为2D热图，-600至1400 ps的时间延迟范围和300至4500 cm^-1的光谱范围。 (b) 系统时间分辨率（FWHM）为547 ps。(c) 拉曼光谱延时3D瀑布图（延时-600至1400 ps，光谱范围-700至700 cm^-1）。 (d) 单模激光拉曼光谱。 (e) 围绕激光峰进行局部放大，显示系统光谱最大分辨率（FWHM）为0.05 cm^-1

为了验证系统的拉曼荧光信号分离能力。团队使用在表面涂覆荧光材料的硅片进行实验(R6G-PVA-Si)。图5a为样品扫描结果热图(时间延迟 -1000-50000 ps，光谱范围为-500-10000 cm^-1)。将热图按照时间延迟进行区域划分可以设置为拉曼区域，拉曼荧光混合区域，荧光区域。图5b为不同区域的光谱均谱。可以看到在拉曼区域有明显的硅峰信号，而随着时间延迟增大，荧光信号开始显现，直到无法看到硅峰信号。结果证明了系统的拉曼荧光分离能力。

图5：R6G-PVA-Si 样本拉曼荧光分离结果图。 (a) 扫描结果2D热图(时间延迟 -1200-50000 ps，光谱范围-500-10000 cm^-1)。 (b) 不同时间延迟范围光谱结果均谱，拉曼(-1000-0 ps)，混合(0-1000 ps)，荧光(1000-5000 ps)。 (c) 脉冲激光、拉曼、荧光光谱强度时间延迟曲线

为了进一步验证系统的时间门控拉曼2D扫描能力，团队使用荧光小球进行实验验证，我们仍将全时间延迟分为拉曼、拉曼荧光混合、荧光三大部分，从图中可以清晰看到在拉曼延迟范围内，能够获得清晰的小球拉曼信号和2D扫描图像。随着时间延迟增加，在混合区域内开始出现明显的荧光信号。再随着时间延迟增加，2D热图中就无法观测到小球的拉曼信号了（图6）。结果证实，该仪器能够有效地分离拉曼信号和荧光信号。

图6：用 5 μm PMMA 和 2 μm PS 塑料微球用 R6G染色后 对样品进行测试。 (a) 拉曼区域、(b) 拉曼荧光混合区域和 (c) 荧光区域。其中 α: 荧光、β: PMMA 拉曼信号、γ: PS 拉曼信号、δ: α(红色)、β(绿色)和 γ(蓝色)组合叠加的伪彩色图像、ε: 不同种小球拉曼和荧光光谱。(d) 光学成像。(e) 荧光寿命热图

总结与展望

本研究提出傅里叶式光子计数时间门控拉曼光谱技术，巧妙地融合光子计数的高灵敏度与傅里叶变换光谱的宽谱高分辨优势，成功突破了传统时间门控拉曼光谱在光谱范围窄和分辨率低方面的核心限制。研究团队通过严谨的实验验证，证实了该平台能够高效分离拉曼与荧光信号，并在单次测量中实现两种成像模态的精准同步，解决了长期以来难以兼顾光谱信息与荧光寿命信息的难题。这一突破性设计有望成为拉曼荧光抑制的关键技术，在化学、生物学、材料科学、药物检测、环境监测等领域展现广阔的应用前景。（来源：中国光学微信公众号）

相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41377-025-02020-8