论文标题： How error correction affects polymerase chain reaction deduplication: A survey based on unique molecular identifier datasets of short reads

期刊：Quantitative Biology

作者：Pengyao Ping, Tian Lan, Shuquan Su, Wei Liu, Jinyan Li

发表时间：21 Apr 2025

DOI：10.1002/qub2.99

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下一代测序（NGS）数据已广泛应用于生物信息学的各类下游分析。为消除测序过程中引入的偏差与错误，科研人员开发了众多PCR去重与纠错技术。然而，针对短读长的PCR去重与纠错进行联合分析的研究尚属空白，尤其缺乏利用UMI数据集评估纯计算方法性能、探究纠错对去重影响的系统性研究。

近日，悉尼科技大学/中国科学院深圳先进技术研究院李金艳教授团队在 Quantitative Biology 期刊发表综述文章"How error correction affects polymerase chain reaction deduplication: A survey based on unique molecular identifier datasets of short reads"。该文不仅全面梳理了短读长PCR去重与纠错领域的最新进展，更通过严谨的比较分析揭示了一个严峻现实：现有纯计算工具虽能消除部分错误，但仍遗留数十万个错误读段未被校正，甚至引入大量新序列，对PCR去重毫无裨益。基于这些发现，文章指明了未来研究方向，为改进计算方法、提升短读长测序质量提供了重要思路。

全文概要

下一代测序（NGS）技术以其前所未有的速度、精度和成本效益，彻底革新了基因组学研究。文库构建与簇扩增阶段的PCR扩增是NGS关键步骤，用于增加DNA/RNA分子片段数量以确保可靠测序。然而，PCR扩增存在固有偏好性，可能产生嵌合分子，其错误分布极为复杂。这些扩增偏差与错误模式严重干扰微生物组分析、变异检测、RNA定量等下游应用。为此，学界已提出多种生物学方法与计算学方法用于PCR去重。

除PCR相关错误外，样本处理和碱基判读（如荧光串扰）等环节也会引入测序错误，进一步削弱数据分析的准确性。因此，克服PCR及其他步骤的偏差与错误对保障NGS数据可靠性至关重要。NGS纠错技术的核心目标是识别并修正fasta/fastq数据集中由PCR或碱基判读导致的错误碱基。图1展示了NGS中分子追踪、PCR去重与纠错的全过程概览。

图1. 分子追踪、PCR去重和纠错过程的示意图概览。(A–C) 展示了UMIs在精确分子追踪中的应用，该过程考虑了测序过程中引入的错误，这些错误可能同时出现在UMI序列和读段序列中。(D–G) 描述了PCR去重过程：⑤表示使用UMI标签去除重复读段，而④-F-⑥描绘了使用校正后的UMI标签消除重复的过程。⑦代表仅使用计算方法去除重复读段。(E−⑧−H) 阐明了旨在消除测序过程中引入的所有错误的计算纠错过程。值得注意的是，去重后的读段集合因所采用的PCR去重过程而异，而纠错方法的过度校正可能会无意中去除真实的原始读段。

短读长PCR去重研究进展

现有PCR去重方法分为两类：一类利用UMI等生化技术精确追踪分子；另一类仅依赖纯计算。两类方法均可按是否使用参考基因组进一步细分（表1）。

表1. PCR去重方法汇总

纠错方法研究进展

纠错算法采用统计/数学模型检测并修正错误以提升数据质量。现有方法均为不依赖UMI的计算方法，可分为k-mer法、多序列比对（MSA）法和de Bruijn图（DBG）法三类，另有一些针对特定场景的专用方法，如表2所示。

表2. 纠错方法汇总

PCR去重方法及纠错方法的多维度性能测试

研究选取11个UMI单端数据集和1个配对末端数据集，系统评估了多种PCR去重方法及纠错方法的综合表现，主要发现如下：

1. PCR去重方法性能比较

1）在11个单端数据集上，NGSReadsTreatment、Nubeam-dedup、BioSeqZip和Fastp四种纯计算方法的去重结果与原始数据集几乎完全一致，说明这些方法仅识别唯一读段，未纠正PCR偏差与错误。

2）三种UMI方法（UMI-tools、AmpUMI、UMIc）使唯一读段数平均减少88.61%、82.97%和88.69%，但UMI-tools和UMIc引入大量新序列（8.24%-20.27%），存在过度纠错。

3）允许错配的工具（ParDRe、Minirmd）可消除部分PCR错误，但错配阈值从0增至3时，唯一读段数持续下降，显示其可能误删真实序列。

4）在配对末端数据集上，多数UMI方法因内存或重建问题失效，而Fastp产生的大量新序列显示其过度纠错倾向。

2. UMI方法间的一致性分析

UMIc与AmpUMI在单端数据集上重叠度较高（86.4%），但UMIc引入的新序列暗示其过度纠错。UMI-tools因依赖参考基因组比对而与其他方法交集较小，表现不稳定。

3. 计算方法与UMI方法的基准对比

AmpUMI的去重结果是所有纯计算方法（允许0错配）的子集。当允许错配时，重叠度下降，证实CD-HIT-DUP、ParDRe、Minirmd可能因过度纠错而扭曲真实读段。

4. 运行效率评估

AmpUMI在UMI方法中速度最快（<1分钟，<550 MB）。多数计算方法在1分钟内完成，但ParDRe耗时超1小时。Minirmd内存效率最佳。

5. 纠错方法性能比较

1）所有纠错方法均引入数万至数十万新序列，且遗留大量错误读段未校正。

2）各方法间唯一读段集合重叠有限，显示结果差异显著，无"通用最优"方法。

3）Coral和Bcool分别在两类数据集上引入新序列最少，与UMI结果重叠度最高。

纠错对PCR去重的影响

将8种纠错方法（BFC、Bcool、Care、Coral、Fiona、Lighter、Pollux和RACER）与3种去重方法（CD-HIT-DUP、ParDRe、Minirmd）组合测试发现：现有纠错方法对PCR去重无益，反而降低与UMI金标准的重叠度。纠错后的去重结果仍远大于UMI去重结果，证实现有方法无法有效还原真实序列。

结论与展望

本研究首次系统揭示了纯计算PCR去重与纠错方法的系统性缺陷：去重结果与UMI金标准差异显著，纠错工具引入大量伪序列，且方法表现高度依赖数据类型。

尽管UMI是缓解不确定性的有效手段，但仍面临挑战：1）UMI自身可能发生PCR错误，难以区分早期PCR错误与真实序列；2）短UMI在大规模测序中易发生碰撞（DAUMI方法可部分解决）；3）实验成本高、耗时长，限制大规模应用；4）基于比对的方法依赖参考序列质量，可能误删真实序列。

未来改进的方向有：1）引入筛选机制：结合序列丰度等信息，准确鉴别真实近似重复，避免误删（如miREC方法的成功实践）；2）整合工作流程：去重工具应记录ID与丰度信息，纠错工具应输出唯一读段，实现无缝衔接（Calib和DAUMI已有成功尝试）；3）深度学习赋能：突破传统k-mer/MSA/DBG框架，结合平台特异性错误模式与机器学习，开发更智能的算法。

本研究为NGS数据处理流程敲响了警钟：唯有正视现有工具的局限性，才能开发出真正可靠、不引入新错误、保留真实序列与丰度信息的理想算法，推动精准医疗与科研进步。

QB期刊介绍

Quantitative Biology （QB）期刊是由清华大学、北京大学、高教出版社联合创办的全英文学术期刊。QB主要刊登生物信息学、计算生物学、系统生物学、理论生物学和合成生物学的最新研究成果和前沿进展，并为生命科学与计算机、数学、物理等交叉研究领域打造一个学术水平高、可读性强、具有全球影响力的交叉学科期刊品牌。

《前沿》系列英文学术期刊

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