2022年9月26日，南京大学龙亿涛教授、应佚伦教授和英国牛津大学Hagan Bayley教授、荷兰代尔夫特理工大学Cees Dekker教授、以色列理工学院Amit Meller教授和荷兰格罗宁根大学Giovanni Maglia教授合作在Nature Nanotechnology期刊上发表了一篇题为“Nanopore-based technologies beyond DNA sequencing”的综述文章，系统回顾纳米孔道技术过去30年在DNA测序之外的进展，探讨和展望了孔道构建、蛋白质分析、单分子化学、信息存储以及生物医药与临床诊疗等方面的应用。应佚伦教授、胡正利副研究员为第一作者，南京大学为第一完成和通讯联络单位。

纳米孔道师法自然，模拟细胞膜表面蛋白质通道，其限域空间提供了最逼近实际生命体系中分子反应行为的场所，可实现在极短的时域内捕获单个分子瞬态变化，从而为探索基础生物化学领域新现象、新规律和新知识提供可靠的单分子电化学测量方法。在上世纪90年代末，“Nanopore”一词被提出用作描述单链DNA分子通过纳米级尺寸的孔道进行单分子测序的技术。经过近30年的发展，除了DNA测序以外，这一单分子分析方法在蛋白质检测与测序、生物化学反应动态测量研究等方面发展迅速并显示出独特的优势。南京大学龙亿涛教授、应佚伦教授团队与国际纳米孔（道）领域研究团队梳理回顾了近年来纳米孔道电化学技术在蛋白质分析和测序、单分子共价化学、液体活检临床应用以及仿生纳米孔道系统构建与应用等方面的发展现状和主要挑战，深入探讨了纳米孔道电化学“限域空间效应”为单分子测量技术带来的新机遇、新挑战和新应用。

图1：极具潜力纳米孔道电化学单分子研究领域。

30年前，纳米孔道最初作为一种生物传感器开发应用于超灵敏核酸测序和无标记生物小分子的单分子传感测量。生物/化学功能化修饰赋予纳米孔道理想的几何尺寸和丰富的界面性质，进一步提高了传感灵敏度和选择性，允许纳米孔道从本体溶液中高效地捕获、识别和传输各种分子和离子。在典型的纳米孔道测量中，单个分析物分子在外加电场作用下进入纳米孔道限域空间，扰动离子流动和分布，产生与分析物尺寸、电性、序列等相关的时序电流响应变化。通过解析单分子电信号的电流幅值与波动程度、持续时间和事件频率等特征差异，纳米孔道在单分子水平上实现了包括DNA、RNA、多肽、蛋白质、小分子代谢物及其复合物在内的多种生物分子的随机传感测量和表征。

目前，纳米孔道技术应用已拓展到多种生化系统中的分子异质性分析、限域相互作用及反应过程实时监测等。从2004年使用α-溶血素纳米孔道检测多肽开始，在蛋白组学研究方面取得了许多重要进展，包括多肽长度与体积表征、多肽/蛋白质翻译后修饰识别与构象变化研究、蛋白质相互作用分析以及酶活性测定。在单分子蛋白质测序方面，主要挑战在于如何利用纳米孔道准确识别解折叠后线性多肽上每一个氨基酸的种类和顺序。最新研究利用DNA聚合酶或解旋酶控制DNA-多肽复合物单体顺次过孔速度，实现了不超过17个氨基酸长度多肽片段的序列测定，实验验证了纳米孔道蛋白质测序的可行性。

图2：(a) 单分子蛋白质识别原理示意图；(b) 基于ClpXP的蛋白质解折叠；(c) 实时监测单分子多肽瞬态构象转换。

蛋白质生物纳米孔道具有天然的限域结构，可以作为优秀的纳米级反应器，应用于多种单分子共价反应研究，其中研究最多的是巯基/硫醇反应。例如，在孔道界面内引入半胱氨酸，利用其侧链巯基与单个分子反应引起的电流变化，实现了单个二硫键可逆形成与断裂过程的实时观测。纳米孔道限域环境与聚合物反应动力学密切相关，通过改变纳米反应器内空间分离的活性基团排布可实现化学反应选择性的调控。研究发现，聚合物骨架中的二硫化物与纳米孔道内半胱氨酸的反应具有位点选择性和区域选择性，强烈依赖于它们在纳米孔道内的相对位置。基于限域选择性化学，在纳米孔道内构建半胱氨酸轨道，通过连续的硫醇-二硫化物交换反应，实现了DNA单分子机器亚纳米级步长的定向行走。

图3：纳米孔道限域单分子聚合物化学反应研究

纳米孔道技术在单分子测序和生化分析方面的研究成果备受关注，为建造纳米孔道仿生系统解决生物学难题提供了借鉴。固体纳米孔道、蛋白质工程以及DNA纳米技术的发展，使得构建能够在体外重现生物孔道功能的人工系统成为可能。一个经典范例是核孔复合物，其核心通道由多种固有无序FG核孔蛋白（FG-Nups）组成且所处体内环境高度复杂，导致核孔输运机制仍未完全阐明。在固体纳米孔道内修饰FG-Nups成功构建了仿生核孔复合物，探究了孔内FG-Nups的构象并证实了FG-Nups上疏水残基以及FG-Nups网络对核孔复合物选择性的重要作用；利用可编程的DNA origami作为支架锚定FG-Nups同样可以得到仿生核孔复合物，借助显微成像技术研究了受限FG-Nups的空间排列，该平台能够用于进一步探索不同类型FG-Nups形成的复杂度更高的网络，为解答生物学中的作用机制问题提供新思路。

图4：基于固体纳米孔道与DNA origami的仿生核孔复合物构建

近几年，纳米孔道技术在临床检测应用方面取得了一系列进展。与实验室制造的“分析样本”相比，临床样本具有更高的复杂性和异质性，这就要求纳米孔道传感技术具有极高的精度、特异性和灵敏度。为了应对上述挑战，研究人员尝试将纳米孔道传感器集成到微流控系统中，开发智能分析方法和设备用于临床样品制备和分析物富集；设计含有荧光基团和猝灭基团的探针分子与体液样本中的目标分析物特异性结合形成复合物，光电同步测量它们及其复合物通过纳米孔道时的信号响应差异；在生物纳米孔道（如OmpG、t-FhuA孔道）孔口处连接一个抗体或蛋白受体诱捕目标蛋白研究两者结合/解离动力学，或者在孔道内装配一个底物结合蛋白检测体液样本中葡萄糖、维生素B1等代谢物小分子的浓度；选择性降解背景分子增强检测特异性同时规避对纳米孔道结构功能的负面影响，比如，最近报道了一种纳米孔道数字计数方法用于量化mRNA表达，该方法使用酶降解寡聚核苷酸探针与mRNA生物标志物结合后的背景分子，无需纯化和PCR扩增，实现了临床样本中SARS-CoV-2冠状病毒的准确测量。

图5：纳米孔道传感技术的生物样本检测流程

未来纳米孔道单分子电化学分析技术的发展仍面临诸多机遇与挑战，主要包括：生物、固体纳米孔道的天然/非天然基团可控修饰；蛋白质纳米孔道从头设计和DNA origami纳米孔道定制合成；构建合适的纳米孔道限域环境精确控制单分子化学反应进程有望用于高效合成；开发大规模集成化便携式纳米孔道仪器系统提高传感精度、时间分辨率和检测效率，可实现准确快速揭示单分子聚合物（如蛋白质、多糖和脂类）的确切组成和单体序列，从而发展用于个体精准诊疗纳米孔道单分子体外诊断技术。（来源：科学网）

相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41565-022-01193-2