作者:张友明等 来源:《自然—生物技术》 发布时间:2012-5-3 13:52:48
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科学家发现直接克隆大片段DNA方法
 
众所周知,微生物能够产生大量具有生物活性的次生代谢产物,比如抗生素(红霉素),抗癌药物(埃博霉素)以及杀虫剂(阿维菌素)等等。近年来盛行的细菌基因组测序工程表明,细菌染色体上存在着大量未鉴定的天然产物生物合成基因簇,又称为“孤儿基因簇”。微生物次生代谢产物大多数是由聚酮合成酶(PKS)和非核糖体多肽合酶(NRPS)等大型复合酶合成的。但是由于一些细菌不能在实验室条件下生长,或者这些“孤儿基因簇”在实验室条件下是沉默的。因此,将这些生物合成基因簇克隆到大肠杆菌的载体上,通过修饰或者替换启动子,然后在一些生长快,易培养和遗传操作简单的异源宿主中表达,是一种发现这些沉默天然产物的有效方法。而且,这些基因簇还可以通过基因删除,插入和交换,产生更多的“非天然”的天然化合物,也就是所谓的天然产物的“组合生物合成”。
 
但是这些天然产物的生物合成基因簇一般都大于10kb, 有的甚至大于100kb。现行的克隆DNA片段的方法不能满足高通量的功能基因组学研究的需要。比如PCR技术和全新的DNA合成只能得到小于5kb的DNA片段。黏粒或者细菌人工染色体(BAC)基因文库的构建和筛选是克隆大型天然产物 生物合成基因簇的经典方法。但是这些方法还需要后续的费时费力的筛选以及复杂的基因簇 缝合工作。
 
留学德国的中国学者符军和卞小莹在张友明博士的主要指导下发现了基于重组工程的直接克隆大片段DNA的方法。传统的重组工程方法一般使用大肠杆菌中的λ 噬菌体Red 操纵子中的Redα, Redβ and Redγ来实现大肠杆菌中的线性DNA片段和环状DNA之间的同源重组。大肠杆菌中的Rac 前噬菌体也包含一对跟Red功能相似的蛋白RecE和RecT 也能用于重组工程。但是先前的研究发现RecE一般只用碳末端的588个氨基酸就足够完成有效地同源重组,尽管不如Red体系效率高。所以Red体系在广泛地应用在基因敲除、插入和修饰等。RecE蛋白包含866个氨基酸残基,远远多于跟它功能相同的蛋白Redα(226个氨基酸残基)。因此研究人员发现全长的RecE蛋白和RecT蛋白能高效的催化两个线性DNA分子的同源重组(linear plus linear homologous recombination, LLHR)。
 
进而,研究人员利用新发现的线性DNA分子的同源重组能够准确的从BAC或者酶切的染色体混合物中直接克隆选择的DNA片段。研究人员应用该技术从纯化的发光杆菌的染色体上直接克隆了十个未知的天然产物的生物合成基因簇(PKS/NRPS,10-52kb),并将它们在大肠杆菌中表达,鉴定了其中两个基因簇的最终产物。全长的RecE蛋白和RecT蛋白介导的直接克隆方法极大的丰富了DNA重组工程技术,也将加速微生物天然产物的生物探矿研究,同时,此项技术还可以应用于人类个体医疗中的基因诊断和研究。相关研究成果发表在国际著名期刊《自然—生物技术》上,由德国德累斯顿工业大学,德国亥姆霍兹感染研究中心,中国湖南师范大学和德国基因桥公司合作完成。(来源:科学网)
 
 
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