作者:甘晓 来源: 中国科学报 发布时间:2020-6-8
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借冷冻电镜慧眼
看清细菌“天然免疫”细节

 

本报记者 甘晓

当病毒入侵哺乳动物细胞时,最初识别病原DNA收到这一“情报”的蛋白发出信号,向下一个蛋白传递,环环相扣,激活天然免疫反应。哺乳动物细胞正是利用这样的多条天然免疫通路介导免疫应答。

那么,细菌等原核细胞又是如何对外源DNA进行“天然免疫识别和应答”呢?

近日,《自然—微生物学》在线发表了中国科学院生物物理研究所高璞、章新政团队的最新研究成果。这项研究着眼一种细菌识别外源入侵DNA的免疫防御系统,即I型限制修饰(Type I R-M)系统。利用冷冻电镜技术,研究人员系统性解析了Type I R-M系统与靶标DNA及两种噬菌体抑制蛋白(Ocr和ArdA)的多种生理构象的三维结构,并配合突变及生化分析,揭示了该系统的组装、催化和调控机制。

6个步骤展开细节

Type I R-M系统广泛存在于原核生物中,可以对宿主自身DNA进行甲基化修饰,并对未经修饰的噬菌体DNA进行识别和切割,从而为宿主细胞提供强大的天然免疫保护。

高璞向《中国科学报》介绍,自1968年这一系统被鉴定以来,许多研究人员利用微生物学、生物化学及分子生物学等手段对其开展了广泛研究。

“例如,我们已经知道该系统包括的亚基(蛋白)种类、不同Type I R-M系统特异识别的靶标DNA序列、Type I R-M系统存在的组装方式以及噬菌体编码蛋白可抑制该系统的活性等。”

但是,在分子甚至原子水平上仍然有很多问题未得到解答,比如不同亚基之间如何相互作用并组装成有特定功能的复合物,Type I R-M系统是否以及如何通过构象变化来精确调控不同的酶活性,Type I R-M动态构象变化的结构基础是什么,噬菌体蛋白抑制Type I R-M系统酶活性的分子机制是什么。

为回答这些问题,必须了解Type I R-M系统在不同构象状态及组装方式下的结构信息。

多年来,高璞一直致力于揭示Type I R-M系统的组装、催化和调控机制。2011年,其在攻读博士期间就解析了该系统DNA识别亚基的晶体结构。2017年,他与中国科学院生物物理研究所梁栋材院士课题组合作,解析了该系统甲基化酶复合物在不结合靶标DNA状态下的晶体结构。而此次的最新成果,则是他们团队与章新政课题组合作,解析了该系统多个生理状态下的冷冻电镜结构。

基于最新研究,研究人员将Type I R-M全酶的工作模型表述为6个步骤:第一,未结合靶DNA时,全酶复合物处于一种动态开放的静息状态;第二,结合靶DNA后,全酶复合物转变为紧凑的转位状态,并将DNA定位于两个R亚基的Motor-1和Motor-2结构域之间;第三,通过水解ATP,两个R亚基开始催化DNA转位,并将DNA从两端拉向Type I R-M复合物,进而形成特殊的DNA环状结构;第四,当DNA转位受阻时,Type I R-M全酶转变为中间态,此时仅有一个R亚基具有DNA转位酶活性;第五,通过两个R亚基的协同作用,全酶复合物进入切割状态,两个R亚基的核酸酶结构域和两个M亚基的催化结构域均靠近DNA,发挥DNA切割和甲基化修饰功能;第六,切割和修饰结束后,全酶复合物与DNA相互分离并返回到初始的静息状态。

冷冻电镜助力“凝固”瞬间

为了更清楚地理解上述状态转变过程,研究人员在冷冻电镜的帮助下“凝固”了其中的多个瞬间。

“首先实验的第一步是要获得高质量的复合物样品,我们采取细胞内共表达以及体外重组相结合的方式,以经典的Type I R-M系统EcoR124I为研究对象,制备了核心复合物M2S1以及全酶复合物R2M2S1。然后,进一步获得了它们与靶标DNA及两种噬菌体抑制蛋白(Ocr和ArdA)的复合物样品。”高璞表示。

接下来,研究人员利用冷冻电镜单颗粒重构方法,摸索了上述多种复合物样品的制样及数据收集条件,并解析了不同分辨率的共10种状态的三维结构。

事实上,围绕Type I R-M系统为什么能够转位、切割以及修饰DNA,前人的研究已经了解其在不同阶段会显示出不同的酶活性,但是却不知道这个大的分子机器发生状态变化的根本原因。

冷冻电镜技术为了解这一过程的空间构象变化提供了“利器”。例如,在第一个阶段,Type I R-M系统只有转位酶的活性、不具有切割和甲基化活性,原因是其酶切活性中心在结构上被“挤”在中间,形成“自我抑制”的状态;而甲基化酶催化域也同时距离DNA较远,导致其不具备甲基化活性。

“从冷冻电镜结果上看,这是非常直观且显而易见的。”高璞介绍。

工具性意义

在原核细胞中,“R-M系统”及“CRISPR-Cas系统”是细菌去除入侵的噬菌体DNA的两种防御系统,而这两种系统都已经被开发成强大的生物学工具,广泛应用于生物医学研究中。

高璞强调,由于R-M系统中的酶能识别特异的DNA序列并进行修饰和切割,因此,当下分子克隆等实验,都要广泛用到R-M系统。不过,Type I R-M系统虽然最早被发现,但由于大家对它的工作机制理解不够透彻,其工具开发一直相对滞后。

因此,对Type I R-M系统工作细节的了解,有助于将来对其进行生物学工具开发。

同时,在细菌对外源DNA的免疫识别方面,此项研究揭示了Type I R-M系统的组装、催化和调控的分子机制,这有助于深入理解该防御系统与噬菌体之间的相互博弈。

在结构生物学技术方面,Type I R-M系统多种生理构象的三维结构解析,是困扰该领域数十年的难题,该工作首次系统性揭示了多种构象的结构基础。

此外,该研究还有望为抗病原菌感染的噬菌体疗法提供依据和思路。

相关论文信息:https://doi.org/10.1038/s41564-020-0731-z

《中国科学报》 (2020-06-08 第1版 要闻)
 
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