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天然碳酸酐酶活性为大肠杆菌琥珀酸发酵提供了关键且充分的CO2浓缩机制 | MDPI Fermentation |
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论文标题：Native Carbonic Anhydrase Activity Provides a Critical and Sufficient CO2 Concentrating Mechanism for Escherichia coli Succinate Fermentation
论文链接：https://www.mdpi.com/2311-5637/12/2/101
期刊名：Fermentation
期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/fermentation
一、引言
随着大气CO2浓度上升及石油资源日益枯竭，微生物发酵合成琥珀酸成为可持续替代路线。琥珀酸作为重要平台化合物，其发酵生产需大量无机碳（Ci）用于三羧酸循环还原分支（rTCA）的CO2固定反应。野生型大肠杆菌可通过内源CO2及大气扩散满足少量Ci需求，但工程化生产菌株因副产物通路被敲除，必须从胞外获取Ci。然而，水溶液中Ci形态受pH调控，HCO3-无法自由跨膜，CO2（aq）易流失且水合速率慢，仅依赖胞质β-碳酸酐酶（Can、CynT）构成的天然CO2浓缩机制（CCM）实现Ci富集。目前，该天然CCM在琥珀酸发酵中的作用尚未被系统研究，异源CCM组分在该过程中的效能对比也未见报道。为此，本研究旨在：（1）探究天然CCM对琥珀酸发酵的重要性；（2）评估三种异源CCM组分在不同环境条件下对无碳酸酐酶菌株的互补能力；（3）验证这些组分能否进一步增强工程菌株的琥珀酸发酵性能。
图1. 大肠杆菌天然与异源CO2浓缩机制（CCM）组分概述及pH的影响。
二、研究过程与结果
本研究以大肠杆菌MG1655与产琥珀酸工程菌株KJ122为对象，构建can 与 cynT 双缺失菌株（ΔCA），并通过分子克隆将can、sbtA、dabAB、CAN.g分别连接到 pTrc99A 载体获得重组质粒，随后通过平板生长实验与发酵实验研究菌株生长情况与代谢物产生情况。
作者首先对比了MG1655和KJ122与其突变株ΔCA在不同pH下的发酵性能（图 2），发现在pH 7条件下，MG1655与MG1655ΔCA无显著差异，两者主要产乳酸。但在高产琥珀酸菌株KJ122中，敲除can/cynT导致48小时延滞期延长，96小时葡萄糖消耗和琥珀酸产量分别下降36.9%和43.7%，平均体积产率降低46.8%。在pH 5.5条件下，KJ122ΔCA几乎不生长、不产酸。这表明天然CA在高效琥珀酸生产中不可或缺。
图2. 大肠杆菌天然CCM在发酵产琥珀酸过程中对Ci获取的重要性。
为了验证天然CCM对大肠杆菌生长的重要性，作者分别在好氧和厌氧条件下研究了大肠杆菌的生长情况（图3,4）。结果表明，在好氧条件下，亲本株可生长，而ΔCA突变株无法生长；仅在5% CO2时完全恢复。厌氧条件下结果类似，ΔCA株在低于5% CO2时基本不生长，只有MG1655ΔCA在pH 7.5和2.5% CO2条件下有极少量生长。证明天然CCM是大肠杆菌在低胞外Ci环境中生长所必须的且KJ122ΔCA的发酵生长对Ci可利用性表现出更高的敏感性。
图3. 碳酸酐酶缺失以CO2和pH依赖的方式损害大肠杆菌的好氧生长。(1) MG1655, (2) KJ122, (3) KJ122ΔCA, (4) MG1655ΔCA。
图4. 碳酸酐酶缺失以CO2和pH依赖的方式损害大肠杆菌的厌氧生长。(1) MG1655, (2) KJ122, (3) KJ122ΔCA, (4) MG1655ΔCA。
由于大肠杆菌天然CCM仅由胞质碳酸酐酶组成，作者将异源CCM组分（sbtA、dabAB、CAN.g.）及对照基因can克隆至pTrc99A后转化至KJ122ΔCA，评估其在低Ci条件下恢复生长与发酵能力（图5,6）。结果表明，在0.05% CO2好氧条件下，除CAN.g.外所有基因均能恢复菌株生长，其中sbtA的恢复效果呈pH依赖性（低pH无效）；提高CO2至0.5%时，所有菌株生长均有改善。厌氧条件下结果类似，但恢复效果弱于好氧。发酵实验中，表达can可部分恢复琥珀酸产量，sbtA效果较弱，而dabAB可基本恢复产量。综上，dabAB和sbtA有潜力作为大肠杆菌天然CCM的功能替代物。
图5. 异源CCM组分在好氧和厌氧条件下均能条件性互补大肠杆菌的天然CO2浓缩机制。(1) KJ122 pTrc99A, (2) KJ122ΔCA pTrc99A, (3) KJ122ΔCA pDabAB, (4) KJ122ΔCA pCan, (5) KJ122ΔCA pSbtA, (6) KJ122ΔCA pCAN.g.。
图6. 异源CCM组分仅能部分恢复KJ122ΔCA的发酵产琥珀酸能力。
最后通过在KJ122中过表达can、sbtA和dabAB基因研究了天然和异源CCM组分对琥珀酸产量的影响，结果显示（表2），葡萄糖消耗、和琥珀酸产量、产率或生产率均无显著提升，说明在实验条件下天然CCM已足以满足需求，可能存在其他限制因素影响琥珀酸的发酵。
表2. 过表达天然与异源CO2浓缩机制组分对大肠杆菌KJ122的琥珀酸发酵性能无显著提升。
三、研究结论
本研究证明大肠杆菌天然的碳酸酐酶活性在琥珀酸发酵中是必要的，缺失后会导致产率大幅度下降，同时也是充分的，过表达异源CCM对琥珀酸发酵性能无显著提升，异源CCM虽能恢复生长但无法完全替代其在发酵产酸中的功能。
期刊介绍
主编：Prof.Dr.Christian Kennes, University of La Coruña, Spain
期刊Fermentation期刊主题涵盖了微生物代谢、菌株改良、生物制药、发酵工艺优化及产品开发、发酵食品和饮料、生物反应器、生物质转化、生物精炼等。
2024 Impact Factor：3.3
2024 CiteScore：5.7
Time to First Decision：19.5 Days
Acceptance to Publication：2.9 Days
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