作者:席鹏等 来源:《光:科学与应用》 发布时间:2024/7/22 15:49:45
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并行曝光读出结构光照明显微镜(PAR-SIM)

 

研究背景

在活细胞中,囊泡的输运,线粒体膜结构的变化,内质网的延伸,以及微管蛋白伸展等都是快速的动态过程,对这些亚细胞尺度的细胞器进行动态甚至实时超分辨观察,有助于人们理解更多生物问题。传统显微镜的分辨率极限大约为200纳米,这一分辨率极大限制了对活细胞在亚细胞尺度下的生物现象的观察、研究和应用。结构光照明显微镜,简称SIM,是公认的能对动态亚细胞结构进行快速超分辨观察的有力工具之一。它在空间中利用干涉产生的摩尔条纹将较高的空间频率调制到能够被物镜接收的低空间频率中,然后通过频谱搬移和融合扩大频谱范围,最终获得超分辨重建图像。同时面阵条纹照明方式使其具有低光毒性,特别适用于活细胞成像。

然而,过去的SIM技术在成像速度上始终存在一定的局限:为了保证分辨率的各向同性,往往使用三个方向的照明条纹依次照明样本的相同区域;同时,在每个照明方向下,分别需要使用逆矩阵进行三次相位移动用于解调分离0级、±1级频谱。因此,在2DSIM中,每一张超分辨图像普遍需要使用九张原始图像进行重建,加之受制于空间光调制器(SLM)切换照明条纹的速度与sCMOS相机的单帧曝光读出速度,这进一步降低了SIM的成像帧率。其中一种解决措施是以画幅换帧率:缩小相机曝光的画幅大小,提高相机帧率,弥补SIM帧率缺陷。但这始终未解决SIM中的画幅帧率与相机每帧画幅大小的乘积受限问题,即时空信息通量受限问题。之前的显微镜研究者一直尝试提高SIM技术的帧率,其中不乏算法角度的各种创新与优化,同时也有从原理上直接尝试利用空域进行重建的方案,但目前依然没有研究从硬件角度来解耦SIM系统时空信息通量受限的策略。

北京大学未来技术学院的席鹏教授和悉尼科技大学、宁波东方理工大学的金大勇教授合作开发了并行曝光-读取的超高时空分辨结构光照明显微镜(PAR-SIM),该成果以"Ultra-high spatio-temporal resolution imaging with parallel acquisition-readout structured illumination microscopy (PAR-SIM)"为题发表在《Light: Science & Applications》。

研究内容

本文中,研究者深入sCMOS相机单帧图片的曝光-读出过程,发现基于卷帘门(rolling-shutter)的曝光工作方式的相机浪费了大量读出时间。而在共聚焦扫描成像中,利用检流计可以实现对样品的高速扫描。将这两者结合起来,通过重新解构相机曝光-读出过程,在曝光的触发信号与产生条纹的空间光调制器(SLM)信号以及扫描视场的振镜控制信号之间进行精密同步:首先将SIM调制的视场区域通过振镜主动投影到同一水平行的传感器区域,以获得3倍成像速率提升;其次,有效地利用传感器上的曝光和读出时间差,进一步提高了2倍的速度。PAR-SIM在不牺牲信噪比的情况下,理论上可以提高6倍的SIM帧率。与现有的投影式SIM只是将条纹简单地共轭到样本上不同,PAR-SIM利用了双轴振镜组将样本上截取出的同一个视场区域经过不同的SIM相位/角度调制后沿着相机像素阵列同一行循环投射到不同传感器区域。与此同时,其他具有对应条纹的并行阵列行中视场区域被读出,实现了同时采集,并产生每帧6个视场的图像。这使得在SIM系统的硬件中,单位时间可以成像的像元数量(即视场×帧率,也称为成像的信息时空通量)大幅提高(图1)。

图1.PAR-SIM原理及效果渲染图和成像结果

系统帧率最终由SLM的条纹切换时间决定,原始图像信噪比也由SLM上条纹曝光的极限时间限制,使得原始数据信噪比最低可至-2.11dB。这种极低的弱调制中,一级频谱的峰值通常非常微弱并很容易被噪声淹没,从而导致参数估计错误。在SIM中,加载到SLM上的图案包含相应照明条纹的方向和周期的信息。因此,研究者提出了一种利用SLM上条纹照明参数作为物理先验的图像重建思路。本工作以照明先验角度为中心设置5°的一级频谱角度搜索范围,这有效提高了照明方向向量的搜索速度,减少了照明方向估计所需的时间。而后集成到重建过程中的参数估计步骤中,进一步提高了重建参数估计的精确性和准确性,增强低信噪比SIM重建的鲁棒性。

随后本文展示了在100nm分辨率下,以132.9兆像素/s(256 Hz×1352×384像素)的时空信息通量进行的超高速SIM成像验证,利用PAR-SIM在该信噪比水平下成功对固定细胞的微管、肌动蛋白和线粒体进行成像,实现了低信噪比下的高保真重建。此外,研究人员利用PAR-SIM在2.45ms的帧时间下还观察到了活细胞线粒体膜抽管化(MDT)和融合等动态互作过程,并对在MDT过程中的线粒体膜尖端进行了动态轨迹追踪、位移以及速度统计。这不仅证实已有文献报道的MDT过程的平均运动速度普遍分布在0.4-3.5μm/s量级,同时PAR-SIM的高时间分辨率能够得到关于MDT轨迹的更精细位移、速度(方向、大小)和运动状态信息(静止、前伸、后退)。这证明了本技术在活细胞动态超分辨观察中的实用性与功能性。

图2. PAR-SIM结果。(a)利用先验和5°搜寻范围精确加速搜索一级极大值位置。(b)PAR-SIM捕捉到的线粒体MDT过程,并对(c)膜尖端进行动态超分辨观察和(d)轨迹追踪及速度统计。

综上所述,PAR-SIM技术成功从硬件角度解耦SIM时空信息通量受限的问题,并且将时空信息通量显著提升一个数量级。同时,在采用了基于物理先验的算法后,有效地解决了低信噪比原始数据的SIM重建问题,最终成功在低信噪比下对活细胞进行轨迹追踪及速度统计。PAR-SIM技术的成功研发标志着超高速超分辨成像技术的新篇章。同时,由于这一技术并不局限于SIM,而是广泛适用于各种需要利用sCMOS相机进行高速成像的领域,研究者希望并行采集-读出模式可以迁移至其他成像技术,如单分子定位显微镜和光片显微镜,为未来生命科学研究和医学诊断提供更多的可能性。

作者信息

本工作第一作者为北京大学-佐治亚理工学院-埃默里大学生物医学工程系联合培养博士研究生徐鑫舳及北京大学未来技术学院生物医学工程系学生王文熠。通讯作者为席鹏教授和金大勇教授。

徐鑫舳,北京大学未来技术学院生物医学工程系博士生,北京大学-佐治亚理工学院-埃默里大学生物医学工程系联合培养博士。研究方向为各类点扩展函数调制的超分辨荧光显微技术,包括STED,SIM, MINFLUX等。

王文熠,北京大学未来技术学院生物医学工程系学生,师从北京大学未来技术学院席鹏教授。研究方向主要包括结构光照明超分辨显微重建算法的开发,包括重建效果与鲁棒性提升与时间空间占用优化。研究期间,开发了商业化结构光超分辨算法Airy-2DSIM,Airy-Polar2DSIM,Airy-3DSIM,Airy-GCSIM等并用于Airy Polar-SIM™ 多模态超分辨成像系统中。同时,其研究内容还包括结构光照明光切片显微成像,偏振成像与荧光图像的反卷积。

席鹏,北京大学未来技术学院博雅特聘教授,国际先进材料学会会士(FIAAM),国家杰出青年科学基金获得者,科技部重点研发计划首席科学家。致力于超分辨显微成像新技术的研究。现担任Advanced Photonics 等五本国际学术期刊的编委。在Nature, Nature Methods等国际期刊发表SCI收录期刊论文100余篇,总影响因子大于800,被引超过6000次。2016年获得中国光学重要成果奖。2022年获得广东省自然科学二等奖(排名第二)。已授权美国专利3项,中国专利19项,编辑专著2部。多次被OPTICA(原OSA)和SPIE组织的国际会议邀请作大会邀请报告。

金大勇,澳大利亚工程院院士,桂冠学者,美国医学与生物工程学会会士,中国光学工程学会会士、常务理事。1979 年2月生于辽宁阜新。2007年于麦考瑞大学获得博士学位,师从激光物理学家Jim Piper教授。2013年荣获澳洲基金委的Future Fellow并在麦考瑞大学组建澳洲纳米生物光子学重点实验室。2015年成为悉尼科技大学终身教授任悉尼科技大学生物医学材料及仪器研究所所长,并于2017年晋升为杰出教授。曾先后组建了澳大利亚生物医学器件与技术转化中心,中澳科技部资助的便携式体外诊断技术联合研究中心。于2015年荣获尤里卡奖,2016年当选澳大利亚百名科技创新领军人物,2017年荣获澳洲科学院工程科学奖,澳大利亚总理科学奖,2021年获澳大利亚桂冠学者计划资助。已发表论文200余篇,包括Nature及其子刊30余篇。2021-2023年连续入选爱思唯尔全球0.1%高被引学者。申请国际专利7项。先后主持或负责各类重大科研项目20项,累计获资助约3.1亿元人民币。(来源:LightScienceApplications微信公众号)

相关论文信息:https://doi.org/10.1038/s41377-024-01464-8

 
 
 
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