■本报见习记者 韩扬眉

从2010年回国至今整整10年，北京生命科学研究所研究员何万中终于在黑暗中找到了一道光，给自己和支持者们交了一份满意“答卷”。

他带领团队原创性地开发了一种新型克隆电镜标记技术，该技术可直接在细胞中遗传编码表达的标记蛋白上原位合成纳米金颗粒，从而实现细胞超微结构上单分子水平的精确识别与定位，为细胞的电镜超微结构单分子水平研究提供了新工具。相关研究成果8月10日在线发表于《自然—方法学》。

何万中称这10年是一场“大冒险”，“原创探索不仅没有效率，还要顶着压力和风险，有的只是坚持只做真正原创工作的信念”。

3年没有成果，“逼”走一位工程师

当今，生命科学已进入分子生物学时代，人们对生命现象的研究已经深入到单细胞、单分子的纳米尺度水平，在这样的尺度范围内定位、识别、操纵目标分子，从而获取功能性的生物化学信息，对生命现象的解读等意义重大。

近50年来，识别细胞中的蛋白质分子主要依赖传统的抗体免疫金标记技术，但受到抗体及抗原的稳定性和特异性、化学固定剂、细胞切片渗透性、胶体金颗粒大小等因素影响，该技术通常标记效率很低（低于10%），甚至无法标记。而发展迅猛的超分辨率荧光显微学成像技术也只能对有标记的少数分子成像。

因此，细胞生物学家迫切希望开发“基于遗传编码的可克隆电镜标记技术”，即通过遗传操作来实现细胞及生物组织在电镜超微结构样品上的分子识别和精确定位。

近年来，利用重金属离子直接与标记蛋白（包括富含半胱氨酸的金属结合蛋白、铁蛋白多聚合体等）结合形成纳米金属颗粒示踪的方式备受关注。

在电镜下，纳米金属颗粒表现为一个“大黑点”，类似荧光显微成像的绿色荧光蛋白，可让目标分子从细胞无数分子中“脱颖而出”。

2007年，何万中在美国加州理工学院做博士后时，就敏锐地注意到2006年David DeRosier博士提出的基于富含半胱氨酸的金属蛋白（MT）开发可克隆电镜标记新概念。何万中独立组建实验室后，立刻着手将MT改造成更好的MTn和MTa，从此走上了长达10年的可克隆电镜标记技术开发之路。

事实上，此前国际上有5个团队先后对该技术有过探索，但因诸多技术障碍没有攻克，如存在无可避免的“背景噪声”导致特异性差、金离子无法有效进入细胞、不耐化学固定剂，合成纳米金颗粒效率低且颗粒极小等。

2010年，入职北京生命科学研究所后，何万中建立团队致力于攻克上述难题。经历3年艰难探索，始终存在的非特异性背景噪声成为他们迟迟难以突破的技术障碍。团队中一位负责该金颗粒合成的工程师认为成功希望渺茫，无奈之下，放弃项目离开了团队。

但何万中不甘心就此止步，“我相信肯定能够解决的”。

消除背景噪声：意外的收获

做生物物理学交叉研究多年的何万中，决定自学化学知识寻找突破口，他把自己关在办公室研读化学文献。

合成纳米金属颗粒的过程中，要想避免背景噪声，需要金离子只与半胱氨酸的硫元素结合。

在一个周末，他读到一篇文献，其中提到，一价金离子可以与氮、氧、硫等诸多元素有不同的结合强度（与硫结合比氮氧更强）。这使他眼前一亮：蛋白质的20种氨基酸由碳、氢、氧、氮、硫等元素组成，如果设计一种方法，找到一种与金离子结合的含硫（巯基）化合物做反应前体，让金离子只与标记上的半胱氨酸的硫结合，而不与其他元素组合，不就可以在形成特异性纳米金颗粒的同时避免背景噪声了吗？

因为手边没有现成化合物，何万中就地取材，在实验室找到巯基乙醇，并“随意”加入含0.1%氯金酸的试管中，现场合成金的硫醇盐做前体，结果发现本应浑浊的液体居然是透明的，随后他把这种“透明”溶液直接加入含有对照蛋白和另外两种标记蛋白的3个离心管中，溶液依然透明（意味着没有形成金颗粒）。

何万中想到了Brust-Schiffrin方法（BSM）合成硫醇（RSH）包被的纳米金颗粒基本原理，立马又加入了强还原剂硼氢化钠溶液。令人意外的现象发生了：含对照蛋白的离心管里依然无色透明，而含标记蛋白的两个离心管变成了深棕色！ “这很有可能意味着背景噪声的消失。”何万中说。

第二天何万中找团队新成员、有着化学背景的金秀梅开展重复实验，但结果怎么都重复不出来，原因在于前一天的“随意”实验没有严格浓度控制。

经过很多次不同浓度的配比探索，终于，在硫醇阴离子与三价金离子浓度比率≥2：1的条件下，上述现象再次重现了。

经过理论和实验分析，何万中发现，经典的BSM合成纳米金颗粒通常是在硫醇阴离子与三价金离子浓度比率< 2：1条件下进行，溶液中会形成不可溶1：1 RSAu（I）金硫醇盐构成金颗粒成核中心。而现在发现的硫醇阴离子与三价金离子的浓度比率≥2：1条件，形成另一种2：1的可溶RSAu（I）金硫醇盐，不能自发形成成核中心，何万中把这种机制命名为“自成核抑制机制（ANSM）”。

这是一个由于实验时试剂浓度不严格而带来的“意外”科学发现。“自成核抑制机制金颗粒合成的化学原理发现，为后续可克隆标记技术在细胞中的实现与优化奠定了坚实的理论基础。”何万中兴奋地说。

随后，何万中带着团队又用了7年时间，攻克了可克隆电镜标记技术在细胞的开发实现中的一系列技术挑战。

他们首先成功开发了一系列针对纯化的标记蛋白特异性合成2~6纳米大小的金颗粒技术，并证明纳米金颗粒是在单个标记分子上形成的；同时利用简单的原核细胞 （大肠杆菌系统）摸索优化出细胞中的标记蛋白上特异性合成纳米金颗粒的实验方案，获得了前所未有的超高标记效率。

经过技术探索和迭代演进，他们又将该金颗粒合成技术推广至哺乳动物细胞。经试验测试证明，该方案已经高度成熟有效，重复率极高，可以推广使用。“这也意味着，在保证细胞超微结构前提下在标记蛋白上高效合成纳米金颗粒的难题，终于被全面攻克了。”何万中说。

做真正的原创技术

令研究人员感到欣喜的是，他们开发的基于自成核抑制机制在富含半胱氨酸标记蛋白上合成纳米金颗粒技术，合成条件比较温和，接近生理条件，可用来开发一系列新型单分子探针，在其他通用抗体、冷冻电镜分子标记等方面也具备应用潜力。

论文3位审稿人均对该研究给予高度评价：“该技术是对前人提出的基因编码电镜标记概念的深入探索与实现”“该研究有望成为电子显微学领域里程碑式的论文”“我认为这项工作是细胞生物学研究方法的重大进展”。

在感到收获的喜悦的同时，何万中坦承，这场“大冒险”很“折腾”，需要超长的耐力，需要不断积累直至灵感闪现的时刻。尽管中途有很多次发文章的机会，但他们都决定沉下心，直到真正创造出可在未来几十年甚至更长时间里被广泛应用的新技术。

接下来，他希望进一步优化技术，从单分子标记拓展到两个甚至更多目标分子的同时标记；通过一些设计，提高分子的表达量，开发适应各种条件的、对目标分子影响更小的标记技术等，让该技术获得国际同行的广泛应用。

相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41592-020-0911-z