研究背景：

甾体药物是临床上不可或缺的一类药物，广泛用于抗炎、抗肿瘤、激素替代治疗及神经精神疾病等领域。5α-雄甾-3,17-二酮（5α-AD）是合成多种重要药物的关键中间体：它既可用于制备雄激素类药物（如二氢睾酮）和抗雄激素药物（如美他诺龙），也可转化为具有抗癌细胞增殖活性的氨基甾体衍生物；更为重要的是，5α-AD还是合成神经活性甾体药物的前体——包括用于治疗重度产后抑郁症的布瑞诺龙（brexanolone）和治疗CDKL5缺乏症相关癫痫发作的加奈索酮（ganaxolone）。然而，传统化学催化氢化法通常产生C5位α构型和β构型的混合物（比例约为2:1），由于两种差向异构体在薄层色谱Rf值和熔点等物理性质上极为接近，分离纯化极为困难，成为制约此类甾体药物高效合成和工业化生产的关键瓶颈。

文章概述：

针对上述挑战，中国科学院天津工业生物技术研究所朱敦明、吴洽庆团队开展了一项系统的研究，克服了传统化学方法在甾体立体选择性还原的难题，实现了药物中间体的绿色合成，为工业规模生产提供了一种高效切可持续的策略，其研究成果近期发表在Advanced Synthesis & Catalysis期刊上。

图文导读：

研究人员以来自密螺旋体属的已知5α-还原酶5αRed-1为探针（该酶对雄烯二酮的转化率仅为48%），通过BLAST序列比对在NCBI公共数据库中检索，筛选获得56个序列一致性在30%–80%之间的候选5α-还原酶基因。所有基因经大肠杆菌密码子优化后，分别克隆至表达载体并在大肠杆菌C43(DE3)宿主中进行异源表达。以雄烯二酮（5 g/L）为模型底物进行活性筛选，结果20个酶表现出中等活性，其中5个酶的转化率超过90%。尤为突出的是，来源于普雷沃氏菌科细菌（Prevotellaceae bacterium）的5αRed-9在24小时内实现了底物的完全转化（转化率100%），产物经气相色谱和核磁共振鉴定为5α-AD，非对映体过量值（de）>99%。序列分析显示，5αRed-9与已知晶体结构的膜蛋白PbSRD5A仅有38%的序列一致性，其氨基酸组成中约58%为疏水残基，推测同属七次跨膜蛋白。尽管尝试了多种表达策略（更换载体、融合标签、分子伴侣共表达、不同宿主菌株等），可溶性活性表达仍受限，提示该酶的内在跨膜特性对重组表达构成了主要障碍。

在优化反应条件（pH 8.0 Tris-HCl缓冲液、25–37°C、5–10%甲醇助溶剂）后，研究团队系统考察了5αRed-9的底物谱。如表1所示，该酶对21种不同取代模式的甾体化合物进行了活性测试。结果表明，5αRed-9对雄烯二酮（1a）和黄体酮（4a）表现出最高的催化活性（相对活性分别为100%和115%），在50 mL放大反应中（底物浓度5 g/L），两者分离收率分别达90%和85%。对17β-羟基取代的底物5a和含有Δ¹?-双键的6a，该酶也表现出中等催化活性，分离收率分别为42%和55%。值得注意的是，甾体骨架上9位、11位和17位羟基的引入显著降低了酶活性——例如，11α-羟基取代的3a活性仅为1a的46%，而11α-羟基取代的13a活性更是降至1a的7%。分子对接分析表明，高活性底物与低活性底物在酶活性中心内的结合模式存在差异：活性较高的1a和4a的C5原子距NADPH辅酶的C4N原子更近，有利于氢负离子传递。在最优条件下，研究团队进一步将反应放大至500 mL规模。以10 g/L（35.0 mmol/L）雄烯二酮为底物、仅需6 g/L（湿菌体当量）的无细胞提取液进行催化，6小时内转化约31.5 mmol/L底物，10小时内达到33.2 mmol/L的产物浓度，时空产率高达13.3 g/L/d，产物分离收率90%、纯度99%。

表1. 5αRed-9对不同甾体底物的相对酶活性及转化率

注：相对活性以底物1a的酶活力为100%计。收率一栏中"/"表示因相对活性较低未进行分离收率测定。反应条件：50 mL体系，底物5 g/L，无细胞提取液（8 g/L湿菌体当量），10% (v/v) 甲醇，GDH 3 U/mL，葡萄糖（3当量），NADP? 0.5 g/L，Tris-HCl缓冲液（100 mM, pH 8.0）。

该酶法路线从根本上解决了立体选择性的难题，展现出良好的工业化应用前景。值得注意的是，5α-AD本身可由植物甾醇经微生物发酵大量获得，因此该酶催化路线与上游原料供应具有天然衔接优势。未来若通过蛋白质工程手段进一步提升该酶的可溶性表达水平和催化性能，同时拓展其对不同取代甾体底物的适应性，则有望在甾体药物绿色制造领域发挥更大作用，为新一代甾体药物的可持续工业化生产提供关键技术支撑。

论文信息：

A Highly Efficient Enzymatic Method for the Sustainable and Stereoselective Production of 5α-H Key Intermediates for Steroidal Pharmaceuticals

Chi Lu, Yu Wang, Rui Zhang, Xi Chen, Zhengbin Zhang, Xuejie Qi, Jinhui Feng, Qiaqing Wu, Dunming Zhu

Advanced Synthesis & Catalysis

DOI:10.1002/adsc.70572

原文链接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adsc.70572

期刊简介：

Advanced Synthesis & Catalysis是有机化学、有机金属化学和应用化学领域最具影响力的期刊之一。该期刊重点发表学术和工业领域关于高效、实用和环境友好的有机合成的新成果，因而具有较高的影响力。主要涉及领域及方向包括：有机化学、无机化学、有机金属化学、绿色化学、均相催化、多相催化、有机催化、酶催化、不对称催化、多相催化、有机合成、不对称合成、合成方法、负载型催化剂和配体设计等。