Yunxiao Xie¹, Dingrui Jia¹, Mohan Qiu², Jinqiu Wang¹, Fang Geng¹. Metabolic profiling of the liquid core and solidified outer layer of preserved duck egg yolk using widely targeted metabolomics. https://www.sciopen.com/article/10.26599/FSAP.2026.9240174

成都大学耿放研究员团队采用广靶向代谢组学方法，系统比较了皮蛋黄（preserved duck egg yolk，PEY）、固化外层（solidified outer layer，S-PEY）和液态内核（liquid inner core，L-PEY）的小分子代谢物谱，旨在揭示碱性腌制过程中S-PEY与L-PEY间代谢物的再分配规律，阐明这些成分变化与独特结构及品质特征形成之间的潜在关联。研究结果为理解皮蛋区域异质性的化学基础提供了新见解，并为皮蛋的质量调控与产品开发提供了科学支撑。

研究背景

皮蛋是源自我国的传统蛋制品。在强碱与金属离子协同作用下，其加工过程发生复杂的组分迁移与结构重组，最终形成独特的色泽、风味与质地。研究表明，蛋白质变性、聚集和凝胶化是皮蛋形成的关键。与蛋清相比，蛋黄含有更高的脂质和蛋白质含量，并且具有更复杂的结构组织。蛋黄被认定为由脂质和蛋白质组成的天然超分子组装体，可进一步分为主要含低密度脂蛋白（low-density lipoproteins，LDL）的蛋黄浆液部分和主要由高密度脂蛋白（high-density lipoproteins，HDL）和卵黄球蛋白组成的蛋黄颗粒部分。

在碱性腌制中后期，鸭蛋黄逐渐形成S-PEY与L-PEY的内外分区。外层凝胶主要由离子键、疏水作用及二硫键维持，形成致密纤维网络；内层则以离子键和氢键为主，经历了颗粒解离与再聚集。碱处理诱导浆蛋白去折叠与聚集是蛋黄凝胶形成的关键，而颗粒则通过二硫键增强凝胶硬度和稳定性。已有研究发现，L-PEY中总蛋白、总脂质和磷含量均高于S-PEY，且磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱丰度分别为后者的19.6倍和13.6倍，表明腌制过程中存在显著的营养迁移与脂质修饰。此外，游离氨基酸和小肽的显著变化与鲜味形成密切相关，代谢组学也已用于阐明晚期糖基化终末产物相关代谢物的变化。

研究结果：

（1）PEY、S-PEY和L-PEY的代谢组学分析

共鉴定出596 种代谢物，主要包括氨基酸及其衍生物（137 种，占22.9%）、脂肪酰（86 种，14.4%）、有机酸及其衍生物（77 种，12.9%）和甘油磷脂（64 种，10.7%）等。其中，L-PEY组的总代谢物累积丰度约为S-PEY组的1.37 倍，但未达到统计学意义（P＝0.851）。总体而言，各组间总代谢物丰度无显著差异。在PEY、S-PEY和L-PEY组中，主要的代谢物类别为糖类，其次是氨基酸及其代谢物以及有机酸及其衍生物，它们共同占总相对丰度的56.4%～79.1%。主成分分析显示组内重复样本聚集良好，在组间尤其是L-PEY与S-PEY/PEY之间存在明显分离趋势；正交偏最小二乘判别分析得分图进一步证实了显著的组间区分，模型参数R²X、R²Y和Q²分别在0.548～0.740、0.994～0.998和0.896～0.962之间。

A. 596 种已鉴定代谢物的主要类别分类；B. PEY、S-PEY和L-PEY组中代谢物亚类的总相对丰度；C.主成分分析得分图，显示3 个样本组之间的总体代谢差异；D～F.分别用于PEY与S-PEY、PEY与L-PEY以及S-PEY与L-PEY两两比较的正交偏最小二乘判别分析得分图。

图1 PEY、S-PEY和L-PEY的代谢物组成概述及多变量分析

（2）PEY、S-PEY 和 L-PEY 的差异丰度代谢物（differential abundance metabolites，DAMs）

基于正交偏最小二乘判别分析模型，采用变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）、差异倍数（fold change，FC）及多重检验校正筛选DAMs，其中VIP阈值设为＞1.2，FDR＜0.05且|log₂FC|≥1。在L-PEY与PEY的比较中，共鉴定出117 个DAMs，包括57 个丰度降低和60 个丰度升高的代谢物，主要成分为氨基酸及其代谢物（30.7%）和脂肪酰（24.7%）。如图2A所示，VIP值最高的5 个最显著DAMs分别为高香草酸硫酸盐、13-HOTrE、环（组氨酰-脯氨酰）、四氢嘧啶和(±)7(8)-DiHDPE(A)。在S-PEY与PEY的比较中，共发现47 个丰度降低的DAMs，其中大部分被归类为脂肪酰（55.3%）。VIP值最大的5 个DAMs为Leu-Pro-Tyr、肉碱C_18:3、肉碱C_16:2、肉碱C_22:5和肉碱C_14:2（图2B）。在L-PEY与S-PEY的比较中，共鉴定出169 个DAMs，包括105 个丰度降低和64 个丰度升高的代谢物，这些DAMs主要由氨基酸及其代谢物（33.7%）和脂肪酰（30.1%）组成。VIP值最高的5 个DAMs分别为(±)14(15)-EpETE、L-2-氨基己二酸、Ser-Ala、肉碱C12:0和肉碱isoC4:0（图2C）。

A. L-PEY与PEY的比较；B. S-PEY与PEY的比较；C. L-PEY与S-PEY的比较。

图2 PEY、L-PEY和S-PEY两两比较中变量投影重要性得分最高的5 种代谢物

（3）PEY、S-PEY 和 L-PEY 中关键代谢物类别变化

甘油磷脂是主要类别，占总相对丰度的30.4%～40.5%。L-PEY组中甘油磷脂的丰度显著高于S-PEY组（P＜0.05），与S-PEY组相比增加了53.2%。丰度最高的10 种甘油磷脂分别是溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine，LPE）（16:0/0:0）、溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）（0:0/16:1）、LPE（18:1/0:0）、LPE（0:0/20:4）、LPE（18:2/0:0）、LPC（20:4/0:0）、LPC（0:0/14:0）、LPC（0:0/18:3）、LPC（0:0/20:3）和LPC（22:6/0:0）。其中，LPE（0:0/20:4）、LPE（18:2/0:0）和LPC（22:6/0:0）在L-PEY组中的丰度明显高于S-PEY组（P＜0.05；图3）。

图3 在PEY、S-PEY和L-PEY中丰度排名前十的甘油磷脂

氨基酸及其代谢产物占总相对丰度的16.2%～25.8%，包括76 种小肽、38 种氨基酸衍生物和23 种氨基酸。L-PEY组中氨基酸及其代谢产物的丰度显著高于S-PEY组（P＜0.001），达到S-PEY组的2.21 倍。这种差异主要归因于游离氨基酸，而非小肽或氨基酸衍生物。具体而言，L-PEY组中小肽和氨基酸衍生物的丰度与S-PEY组相比无显著差异（P＞0.05），而游离氨基酸在L-PEY组中显著更丰富，是S-PEY组的2.74 倍（P＜0.001）。如图4所示，10 种最丰富的氨基酸及相关衍生物为焦谷氨酸、γ-氨基丁酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、赖氨酸、L-谷氨酸、天冬氨酸、N-甲酰甘氨酸、缬氨酸-苏氨酸和组氨酸。其中，焦谷氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、赖氨酸、L-谷氨酸、天冬氨酸和组氨酸在L-PEY组中的丰度显著高于S-PEY组和PEY组（P＜0.05）。

图4 在PEY、S-PEY和L-PEY中丰度排名前十的氨基酸及其衍生物

有机酸及其代谢物占小分子代谢物总量的9.9%～12.8%。在L-PEY、S-PEY和PEY之间，该类代谢物的总丰度没有显著差异。然而，部分单个化合物表现出显著变化。如图5所示，丰度最高的10 种代谢物分子包括3-磷酸甘油、2-十二烷基苯磺酸、11-羰基-β-乙酰基乳香酸、丁二酸酐、胍基乙酸、柠檬酸、亚氨基二乙酸、异香椽酸、奎尼酸和水杨酸乙酯。其中，与S-PEY相比，L-PEY中丁二酸酐、胍基乙酸和亚氨基二乙酸的丰度显著更高，而柠檬酸、异香椽酸和奎尼酸在S-PEY中的丰度显著高于L-PEY（P＜0.05）。

图5 在PEY、S-PEY和L-PEY中丰度排名前十的有机酸及其衍生物

在色胺、胆碱和色素相关类别中检测到的代谢物包括胆碱、Sn-甘油-3-磷酸胆碱和色胺。其中，胆碱占总相对定量丰度的9.3%～10.1%，而色胺占总相对定量丰度的0.005%～0.012%。与S-PEY组相比，L-PEY组中色胺的丰度显著更高（图6A；P＜0.05）。

脂肪酸占总相对丰度的5.3%～10.7%，包括38 种酰基肉碱、22 种氧化脂质、20 种游离脂肪酸和6 种其他化合物。S-PEY组中脂肪酸的总丰度显著高于L-PEY组（P＜0.001），相对于L-PEY增加了49.2%。具体而言，与L-PEY相比，S-PEY中酰基肉碱和游离脂肪酸的丰度显著更高（P＜0.05），但氧化脂质未观察到显著变化。丰度最高的10 种脂肪酰包括tetranor-12(R)-HETE、花生四烯酸、游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）（22:5）、12,13-EpOME、肉碱C_2:0、FFA（16:2）、FFA（12:0）、FFA（20:2）、FFA（16:3）和肉碱C18:1（图6B）。S-PEY组中花生四烯酸、FFA（22:5）、12,13-EpOME、FFA（16:2）、FFA（20:2）和FFA（16:3）的丰度显著高于L-PEY组（P＜0.05），而L-PEY组中肉碱C_2:0和肉碱C_18:1的丰度显著高于S-PEY组（P＜0.05）。

图6 在PEY、S-PEY和L-PEY中鉴定出的3 种与色胺、胆碱和色素相关的代谢物（A）以及按丰度排名的前十的脂肪酰代谢物（B）

讨论

代谢组学结果显示，L-PEY与S-PEY在小分子代谢物组成上存在明显差异。其中，L-PEY甘油磷脂和游离氨基酸更为富集，而S-PEY中脂肪酰类代谢物含量更高，表明液态内核皮蛋蛋黄并不是一个均一体系，而是具有明显的区域性代谢特征。在L-PEY中，甘油磷脂是主要代谢物类别之一，尤其是LPC和LPE等溶血磷脂表现出明显富集。这可能与L-PEY较高的流动性和较弱的凝胶网络约束有关。在碱腌过程中，蛋黄脂蛋白结构逐渐发生破坏、迁移和重组，部分磷脂及其水解产物更容易向L-PEY区域迁移并积累。因此，L-PEY可能成为磷脂来源小分子的优先富集区域。同时，液态内核区中游离氨基酸含量显著高于固化外层。与小肽和氨基酸衍生物相比，游离氨基酸是造成两区域差异的主要贡献物质。这表明L-PEY不仅结构更疏松，也可能更有利于蛋白水解产物的释放、保留和提取。谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等风味相关氨基酸在流心区的升高，可能与其更明显的鲜味、滋味复杂性和整体风味层次有关。与L-PEY不同，S-PEY中脂肪酰类代谢物显著富集，尤其是游离脂肪酸和酰基肉碱含量更高。这可能与外层蛋黄较早发生凝胶化有关。外层形成的致密蛋白-脂质网络，一方面可能限制脂质水解产物继续向外扩散，另一方面也有利于脂肪酸等脂质来源小分子的局部保留。因此，固化外层可能更容易积累与脂质风味和后味特征相关的代谢物。从风味形成角度看，L-PEY富集的游离氨基酸和部分有机酸，可能有助于增强鲜味、酸味、咸味及滋味平衡；而S-PEY富集的游离脂肪酸和多不饱和脂肪酸衍生物，则可能与脂质氧化香气、脂香和后味特征有关。这些结果为理解液态内核皮蛋蛋黄“内外风味差异”的物质基础提供了新的线索。总体而言，液态内核皮蛋蛋黄的品质形成不仅取决于整体成分变化，更与蛋黄内部不同区域的结构演变、物质迁移和代谢物富集密切相关。L-PEY表现出以磷脂和游离氨基酸富集为特征的代谢模式，而S-PEY则表现出以脂肪酰类代谢物富集为特征的代谢模式。后续仍需结合靶向定量、挥发性风味分析和感官评价，进一步验证这些代谢差异对风味形成的实际贡献。

结论

本研究在PEY、L-PEY和S-PEY中共鉴定出596 种代谢物，其中氨基酸及其代谢物、脂肪酸以及有机酸及其衍生物是主要类别。从累积相对丰度来看，甘油磷脂、氨基酸及其代谢物以及有机酸及其衍生物成为主要类别。在PEY、S-PEY和L-PEY之间观察到明显的代谢分化，尤其是在S-PEY和L-PEY之间，共鉴定出169 个差异代谢物。L-PEY的特征是丰度更高的两亲性甘油磷脂和游离氨基酸，包括L-谷氨酸和天冬氨酸等鲜味相关氨基酸；而S-PEY则显示出显著更高丰度的脂肪酸，尤其是游离脂肪酸，这些可能作为脂源性挥发性化合物的重要前体。