论文标题：Establishment of a High-Efficiency Protoplast Isolation and Transient Transformation System for Chrysanthemum Petals

论文链接：https://doi.org/10.3390/horticulturae12040425

期刊名：Horticulturae

期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/horticulturae

导读

菊花（Chrysanthemum × morifolium Ramat.）是广受全球喜爱的观赏花卉，但绝大多数栽培品种缺少高效的花瓣瞬时转化体系，制约了花器官性状分子机制的深入研究。植物原生质体无细胞壁束缚，易摄取外源遗传物质，是基因功能验证、亚细胞定位、蛋白互作研究的理想材料。传统育种与现有基因功能验证技术的局限，严重阻碍菊花分子育种进程，建立高效瞬时转化体系对快速鉴定关键基因功能至关重要。来自北京林业大学园林学院戴思兰教授和洪艳教授团队在 Horticulturae 期刊发表了题为“Establishment of a High-Efficiency Protoplast Isolation and Transient Transformation System for Chrysanthemum Petals”的研究文章，建立了一套稳定高效的菊花花瓣原生质体分离及PEG介导的瞬时转化体系，并利用该体系完成了菊花内源基因CmVIT1的亚细胞定位。文章还讨论了这套高效的花瓣原生质体制备-遗传转化体系在单细胞研究、蛋白-核酸/蛋白互作分析、无DNA基因组编辑及原生质体再生等研究方向应用潜力。

研究过程与结果

团队以菊花品种‘万代风光’为材料，采用L9(3⁴)正交设计，系统优化花瓣原生质体分离条件，结果表明：原生质体分离最优体系为0.6 M甘露醇、4%纤维素酶R-10、0.4%离析酶R-10、酶解8 h，原生质体产量达5.14×10⁶个?g^-1FW，活力87.41%，是已报道体系的18.3倍。将这一体系用于菊花其它6个种质中，获得的原生质体的活力均超过85%，其中最高的达到97.84%（图1）。

图1. 菊花花瓣原生质体分离及不同种质原生质体产量与活力测定

利用PEG介导菊花花瓣原生质体瞬时转化试验的结果表明：瞬时转化最优条件为40% PEG4000、质粒用量12 μg、转化时间10 min、原生质体密度1×10⁶个•mL^-1，转化效率达51.50%，约为已报道体系的1.7倍。同样，这一体系在6份不同类型菊花种质中均适用，转化效率均超30%（图2）。

图2. PEG介导菊花花瓣原生质体瞬时转化体系的优化与不同种质转化效率鉴定

随后利用该体系检验菊花液泡铁转运蛋白CmVIT1的亚细胞定位，证实其定位于液泡膜（图3）。

图3. 菊花‘万代风光’花瓣原生质体中CmVIT1的亚细胞定位

研究总结

本研究建立了一套稳定高效的菊花花瓣原生质体分离及PEG介导的瞬时转化体系，并利用该体系完成了菊花内源基因CmVIT1的亚细胞定位。该体系在6份遗传背景各异的菊花种质中均表现出良好适用性，可实现菊花花器官性状相关基因的快速功能验证。此外，这套高效的花瓣原生质体制备-转化体系在单细胞研究、蛋白-核酸/蛋白互作分析、无DNA基因组编辑及原生质体再生等研究方向也具有应用潜力。

Horticulturae 期刊介绍

主编：Luigi De Bellis, Università del Salento, Italy

期刊重点关注温带到热带园艺的所有领域及相关学科，主题包括果树、蔬菜、花卉、苗圃和风景以及草药和香料作物等，研究涉及整个园艺供应链。