论文标题：Characterization of Extracellular Vesicles from Human Saliva: Effects of Age and Isolation Techniques

论文链接：https://www.mdpi.com/2073-4409/13/1/95

期刊名：Cells

期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/cells

前言

唾液，作为一种极易获取、无创采集的生物体液，正逐渐成为疾病生物标志物研究的热点。其中，唾液中的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs） 携带蛋白质、核酸等多种分子，反映了分泌细胞的状态，具有极大的诊断潜力。然而，目前缺乏对不同EV分离方法的系统性比较，限制了唾液EV在临床中的应用。此外，年龄是否影响唾液EV的特性也尚不明确。本研究首次系统比较了8种EV分离技术在年轻和老年人群体中的表现，为未来基于唾液EV的疾病标志物研究提供了重要参考。

实验方法

1. 样本采集：收集年轻（24-29岁）和老年（60-70岁）健康志愿者的空腹唾液。

2. EV分离技术：比较了8种方法，包括：

• 沉淀法：ExoQuick-TC ULTRA、Invitrogen Total Exosome Isolation Solution、Norgen Saliva Exosome Purification Kit、ExoGAG

• 尺寸排阻色谱（SEC）：Izon qEVOriginal-70nm、Exo-spin、SmartSEC Single

• 差速超速离心（UC）

3. 磁珠免疫捕获：使用抗CD9、CD63、CD81抗体对EV进行进一步纯化。

4. EV表征：包括纳米颗粒追踪分析（NTA）、蛋白浓度测定（BCA）、Western blot、透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）。

实验结果

1. EV浓度受年龄、分离方法和免疫捕获影响显著

• 老年人唾液EV浓度总体高于年轻人。

• Invitrogen方法获得的EV浓度最高，ExoQuick-TC ULTRA和Norgen方法最低。

• 磁珠免疫捕获后，EV浓度显著下降。

如图1所示，不同方法在年轻和老年人中的EV产量差异明显，且Norgen和ExoQuick-TC ULTRA在免疫捕获后EV回收率最高（可达86%）。

图 1. 在年轻人和老年人中，使用抗体进行磁珠免疫捕获前后，每种技术获得的唾液 EV 产量。

2. EV粒径受年龄和免疫捕获影响，与方法无关

• 年轻人EV粒径显著大于老年人。

• 免疫捕获后，EV粒径普遍减小。

如图2展示了不同方法下EV粒径的分布，显示年龄和免疫捕获是主要影响因素。

图 2. 分别在年轻人和老年人中，使用抗体进行磁珠免疫捕获前后，采用每种技术获得的平均唾液细胞外囊泡 (EV) 大小。

3. 蛋白浓度与纯度差异显著

• Invitrogen方法蛋白浓度最高（年轻组306.9 μg/mL），但纯度最低。

• Izon qEVOriginal-70nm方法纯度最高，蛋白浓度最低。

• Norgen方法在蛋白浓度和纯度之间取得了良好平衡，且操作简便、成本低。

图3清晰展示了各方法的蛋白浓度与粒子-蛋白比（纯度）。

图 3. 进行磁珠免疫捕获前，采用各种技术获得的唾液细胞外囊泡 (EV) 的蛋白浓度和纯度比较。

4. Western blot与TEM验证EV特性

• 所有方法均能检测到CD63、CD81、flotillin-1等EV标志物。

• 磁珠免疫捕获后，APOB和白蛋白等污染蛋白显著减少。

• TEM图像显示，大多数EV粒径在30-60 nm之间，老年人中更小粒径EV比例略高。

图4和图5分别展示了Western blot结果和透射电镜图像，验证了EV的典型形态与标志物表达。

图4. 采用八种技术分别在年轻人和老年人唾液中采集细胞外囊泡（EVs），并在进行磁珠免疫捕获前后进行Western blot分析。

图 5. 进行磁珠免疫捕获后，采用不同技术获得的唾液细胞外囊泡 的透射电镜成像分析。

5. 年龄影响的群体验证

使用Norgen方法对10名年轻人和10名老年人进行验证，结果与前期一致：

• 老年人EV浓度更高。

• 免疫捕获后EV粒径减小。

• 蛋白浓度和纯度在两组间无显著差异。

图6展示了该验证实验的主要结果，进一步证实了年龄对唾液EV的影响。

图 6. 使用 Norgen 唾液外泌体纯化试剂盒获得的唾液外泌体 (EV) 的年龄效应。

总结

本研究首次系统比较了8种唾液EV分离技术在年轻和老年人群体中的表现，得出以下关键结论：

• 若追求高纯度，推荐使用 Izon qEVOriginal-70nm 尺寸排阻色谱法。

• 若追求高产量且兼顾纯度与成本，Norgen Saliva Exosome Purification Kit 是最佳选择。

• 年龄显著影响唾液EV的浓度和粒径，在开发基于唾液EV的生物标志物时需考虑年龄匹配。

• 磁珠免疫捕获可显著提高EV纯度，适用于下游蛋白质组或核酸分析。

这项研究为标准化唾液EV的分离流程、推动其在疾病诊断和衰老研究中的应用奠定了坚实基础。

期刊介绍：

主编：

Prof. Dr. Cord Brakebusch, The University of Copenhagen, Denmark

Dr. Alexander E. Kalyuzhny University of Minnesota, USA

Cells涵盖了与细胞生物学和生理学、分子生物学和生物物理学相关的所有主题。期刊已被Scopus, SCIE (Web of Science), PubMed, MEDLINE, PMC, CAPlus / SciFinder, 等数据库收录。

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