论文标题：肺腺癌和鳞状细胞癌来源的小细胞外囊泡改变T细胞因子表达并调节sEV生物发生中的蛋白质谱

论文链接：https://www.mdpi.com/2227-7382/13/2/15

期刊名：Proteomes

期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/proteomes

尽管免疫治疗取得了显著进展，但非小细胞肺癌（NSCLC）的临床成功率仍然有限，部分原因可能是晚期癌症患者体内存在严重的免疫系统异常。肿瘤细胞释放的小细胞外囊泡（sEVs）是介导免疫逃逸的重要机制之一。

Proteomes 发表的一项研究，从肺腺癌（ADC）和肺鳞状细胞癌（SCC）细胞系中分离sEVs，系统探究了它们对T细胞免疫功能的调节作用及其分子机制。

一、研究背景

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌病例的80%，主要亚型包括腺癌（ADC）和鳞状细胞癌（SCC）。尽管免疫治疗不断发展，肿瘤微环境中复杂的免疫学改变仍是导致临床效果不佳的主要原因。

肿瘤细胞会大量产生并释放sEVs（根据国际细胞外囊泡学会MISEV指南，直径30-200 nm的囊泡统称为小细胞外囊泡），这些囊泡携带与亲代细胞相似的分子成分，包括蛋白质、核酸等。已有研究表明，肿瘤来源的sEVs可以携带多种免疫抑制信号，导致T细胞功能障碍。然而，不同NSCLC亚型来源的sEVs如何影响T细胞活性，目前尚不清楚。

二、研究方法

细胞模型：

• 肺腺癌细胞系A549

• 肺鳞状细胞癌细胞系SKMES1

• T细胞系Jurkat E6.1

sEVs分离与表征：采用沉淀法从细胞培养基中分离sEVs，通过纳米颗粒追踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）表征粒径和形态，Western blot验证sEVs标志物（CD9、CD63，Calnexin作为阴性对照）。

sEVs摄取与细胞活力：使用PKH67荧光标记sEVs，与T细胞共培养后通过荧光显微镜观察摄取情况；采用Resazurin法评估细胞活力。

基因表达分析：通过实时荧光定量PCR检测免疫相关基因（IL10、TGFB1、BAX、GZMB、IL2、IL6、KI67、BCL2、TNFA）的表达变化。

蛋白质组学分析：采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行无标定量蛋白质组学分析，鉴定差异丰度蛋白（DAPs），并进行Gene Ontology（GO）功能富集分析。

三、研究结果

1. sEVs的表征

NTA显示A549细胞来源sEVs的粒径约为130 ± 20 nm，浓度为2.2 × 10⁶颗粒/mL培养基。TEM观察到30-180 nm的球形结构。Western blot检测到CD9和CD63阳性信号，Calnexin阴性，证实了sEVs的成功分离。

图1. sEVs的表征。

2. sEVs的摄取与T细胞活力

荧光显微镜观察显示，PKH67标记的sEVs（绿色）被T细胞内化，分布在细胞质中。Resazurin活力测定表明，在sEVs处理后的前2小时，T细胞活力降低，随后趋于平衡。

图2. (a) T细胞摄取A549来源的小细胞外囊泡（sEVs）。sEVs标记为绿色，细胞核为蓝色，质膜为红色。细胞质中出现的绿色荧光表明PKH标记的sEVs已被成功内化。(b) 癌症来源的sEVs对T细胞活力的影响。使用从A549和SKMES1细胞中分离出的sEVs处理T细胞24小时，并通过刃天青（resazurin）测定法评估细胞活力。记录加入刃天青后最初4小时内的荧光信号。缩写：T，Jurkat E6.1细胞；T + A549_Exo，经A549来源sEVs处理的Jurkat E6.1细胞；T + SKMES_Exo，经SKMES1来源sEVs处理的Jurkat E6.1细胞（星号对应p值为0.0011）。

3. T细胞基因表达的变化

实时荧光定量PCR结果显示，肺腺癌和鳞癌来源的sEVs处理后，T细胞中多个关键基因的表达发生显著变化：

• 下调的基因：Ki67（增殖标志物）、BCL2和BAX（凋亡相关）、TNFα和IL6（炎性细胞因子）、TGFβ和IL10（免疫抑制性细胞因子）均显著下调（p < 0.0001）

• 上调的基因：GZMB（颗粒酶B）和IL2（白细胞介素-2）在两组中均上调

4. 差异丰度蛋白（DAPs）分析

蛋白质组学分析鉴定出：

• 肺腺癌sEVs处理T细胞：39个DAPs

• 肺鳞癌sEVs处理T细胞：276个DAPs

• 两组共有的DAPs：19个

GO功能富集分析显示：

• 肺腺癌组特有的DAPs富集于NAD代谢过程、核苷酸磷酸化、氧化还原酶活性、细胞外基质（ECM）结合、清道夫受体活性等

• 肺鳞癌组特有的DAPs富集于mRNA分解代谢与稳定性调控、翻译调控、氨基酸代谢过程、钙黏蛋白结合、未折叠蛋白结合等

• 共有蛋白的细胞组分分析显示这些蛋白定位于细胞质和细胞外腔，提示它们可能被T细胞进一步以sEV形式释放

四、研究结论

本研究证实，肺癌细胞来源的sEVs能够被T细胞有效摄取，并调节T细胞的细胞因子谱和活性。具体发现包括：

• 肺癌sEVs处理后，T细胞的Ki67、BCL2、BAX、TNFα、IL6、TGFβ和IL10表达下调，提示细胞增殖减少、凋亡失调、炎症信号和免疫抑制信号受损

• GZMB和IL2的上调提示细胞毒性潜力保留但T细胞激活可能功能失调

• 蛋白质组学分析揭示了两组T细胞中39个（肺腺癌组）和276个（肺鳞癌组）DAPs，其中19个共有

• GO分析显示这些DAPs参与sEV生物发生、代谢通路和调控功能

• 细胞质定位提示这些蛋白可能被T细胞进一步以sEV形式释放

这些发现揭示了肺癌来源sEVs通过免疫调节信号调控T细胞活性的分子机制，为理解肿瘤免疫调控机制和发现新的治疗靶点提供了线索。

五、延伸阅读

如果您对外泌体在疾病与再生医学中的作用感兴趣，本期推荐的两篇文章也值得一读：

1. 细胞外囊泡蛋白质组学在角膜再生医学中的应用

https://www.mdpi.com/2227-7382/13/4/49

该综述全面考察了EVs在角膜再生医学中的蛋白质组学景观，重点关注间充质干细胞（MSCs）来源的EVs。EVs通过调节炎症、支持上皮和基质再生、促进神经修复，在角膜愈合中发挥作用，其治疗潜力很大程度上归因于所携带的生长因子、细胞因子和参与细胞外基质重塑的蛋白。

核心内容：

• EVs在角膜再生中的作用机制：支持上皮损伤修复、调节免疫反应和抗纤维化、抑制血管生成、促进神经再生

• 蛋白质组学技术：LC-MS/MS用于鉴定和表征EVs的蛋白内容物

• 来源差异：骨髓、脂肪组织、脐带等不同MSC来源的EVs具有不同的蛋白质组学特征

• 预处理影响：缺氧、炎症等环境因素可改变EVs的蛋白组成

• 关键蛋白：参与血管调节（VEGF、MMP-2）、抗纤维化（decorin、TIMP-2）、神经保护（NGF、BDNF）和炎症调节（TGF-β、IL-10）的蛋白

图2. 细胞外囊泡（EVs）在角膜再生中潜在作用机制的示意图。

2. 人顶体蛋白质组中的固有无序与相分离协调胞吐作用、运动和染色质重塑

https://www.mdpi.com/2227-7382/13/2/16

本研究通过生物信息学方法，分析了人顶体蛋白质组中250种蛋白质的固有无序区域和液-液相分离（LLPS）倾向。研究发现约81%的顶体蛋白具有中到高水平的无序结构，这些无序区域通过促进快速、多价的相互作用和动态分子组装，在囊泡融合、酶释放等过程中发挥关键作用。约30%的顶体蛋白是LLPS的高概率驱动者。该研究还发现，固有无序与LLPS倾向之间存在显著的正相关关系（p < 0.0001, R² = 0.649）。虽然该研究未直接以外泌体为主题，但其揭示的蛋白质无序性和相分离机制，与EVs生物发生和货物分选过程中的动态组装机制具有重要的理论关联。

图16. 肉豆蔻酰化丙氨酸富集C激酶底物（MARCKS，UniProt ID: P29966）的功能性无序分析。(A) 由RIDAO生成的固有无序分布图。(B) 由D2P2生成的功能性无序分布图。(C) 置信度阈值为0.4时的MARCKS蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。

Proteomes 期刊介绍

主编：Jens R. Coorssen, Institute for Globally Distributed Open Research and Education (IGDORE), Canada; Matthew P. Padula, The University of Technology Sydney, Australia

期刊专注于蛋白质组分析的各个方面，特别关注蛋白质组在蛋白质形式（proteoforms）、功能性生物学单元以及标准氨基酸序列水平上的表征和定量。目前已被Scopus、ESCI (Web of Science)、PubMed等数据库收录。

2025 Impact Factor: 4.3

2025 CiteScore: 6.4

Time to First Decision: 27.9 Days

Acceptance to Publication: 5.5 Days