论文标题：Effect of Chitosan Degradation Products, Glucosamine and Chitosan Oligosaccharide, on Osteoclastic Differentiation

论文链接：https://www.mdpi.com/2673-6284/13/1/6

期刊名：BioTech

期刊主页： https://www.mdpi.com/journal/biotech

一、研究背景

壳聚糖是由甲壳素脱乙酰化制备的天然阳离子多糖，具备良好生物相容性、可降解性与抑菌能力，是骨组织修复支架的热门生物材料，植入人体后会被溶菌酶分解为氨基葡萄糖（GlcN）、壳寡糖（COS）两类小分子降解产物。目前学界对于两种降解产物调控破骨细胞分化的效果存在争议，部分研究提出低浓度壳寡糖会促进破骨细胞生成，加速骨吸收、阻碍骨修复进程，高浓度产物则存在抑制效果，而低浓度氨基葡萄糖对破骨细胞的作用尚无明确报道。若降解产物具备促破骨分化活性，壳聚糖骨修复材料的临床使用将存在安全隐患，为此本研究选取高低两组典型浓度，同时采用人外周血单核细胞、小鼠 RAW264 巨噬细胞两套细胞模型开展平行实验，系统验证 GlcN 与 COS 对破骨细胞分化的真实影响，为壳聚糖骨植入材料的安全应用提供实验依据。

二、材料与方法

实验设置 0.5 μg/mL 低浓度、500 μg/mL 高浓度两个处理组，分别对应过往文献中促分化、抑分化的常用给药浓度，选用聚合度 2-6 的壳寡糖与盐酸氨基葡萄糖作为受试样品。细胞层面，人 PBMC 细胞诱导分化周期为 10 天，同步添加 M-CSF 与 RANKL 两种破骨分化关键诱导因子；小鼠 RAW264 细胞诱导周期为 4 天，仅采用 RANKL 刺激，空白对照组不添加诱导因子。细胞活性通过 CCK-8、PrestoBlue 试剂盒检测，采用 TRAP 酶活定量、TRAP 染色多核破骨细胞计数、肌动蛋白环荧光染色三种经典手段评价破骨分化水平，全部数据采用单因素方差分析结合 Tukey 多重比较完成统计学检验，所有实验至少重复两次以保证结果稳定可靠。

三、结果与分析

本次研究开创性地同步采用人源原代细胞与鼠源细胞两套实验体系，对比高低梯度氨基葡萄糖、壳寡糖对破骨分化的作用，彻底推翻了低浓度壳寡糖诱导骨吸收的过往争议观点，证实两类降解产物完全不具备激活破骨细胞的能力，仅高浓度环境下可显著抑制破骨成熟。针对现有文献结论出现分歧的核心诱因，文章分析指出商用壳寡糖原料之间聚合度、脱乙酰度参数差异巨大，分子链长短、乙酰基团占比会直接改变多糖抗氧化、信号调控活性，这也是不同课题组实验结果相悖的关键变量，该推论也为后续同类标准化体外实验提供了重要变量控制思路。

图1. GlcN和COS对人PBMCs和小鼠RAW264细胞细胞存活率的影响。(a) 将人正常PBMCs在低浓度（0.5 μg/mL；(L)）或高浓度（500 μg/mL；(H)）的GlcN或COS存在下，用M-CSF和RANKL处理10天。随后使用Cell Counting Kit-8试剂进行细胞存活率检测。(b)) 小鼠RAW264细胞在低浓度（0.5 μg/mL；(L)）或高浓度（500 μg/mL；(H)）的GlcN或COS存在下，用RANKL处理4天。之后使用PrestoBlueTM试剂进行细胞存活率检测。数据以平均值±标准差表示（n = 8或4）。N.S.表示无显著性差异。

从分子作用机制层面，研究梳理出两条独立抑制通路用以解释高浓度降解产物的功能表现。

其一，壳寡糖拥有优良超氧自由基清除活性，而活性氧分子是启动 RANKL 介导破骨分化的核心信号介质，高剂量多糖可消耗胞内活性氧，阻断下游破骨细胞成熟程序；

其二，氨基葡萄糖进入细胞后会流入己糖胺合成通路，大量生成 UDP-GlcNAc，提升细胞内蛋白 O-GlcNAc 修饰水平，干扰 MAPK、NF-κB 等促分化信号通路传导。同时文章结合人体口服补充氨糖的真实体内血药浓度做对比分析，日常口服补充后体内氨糖浓度仅 2 μg/mL，远低于本实验低剂量 0.5 μg/mL 处理组，常规膳食、保健品摄入不会干扰人体骨代谢平衡，但长期超大剂量补充仍存在潜在骨重塑调控风险，为骨关节保健品研发与临床服用剂量把控提供体外数据支撑。

图2. GlcN和COS对人外周血单核细胞（PBMCs）和小鼠RAW264细胞中TRAP酶活性的影响。(a) 人正常PBMCs和(b)小鼠RAW264细胞在低浓度（0.5 μg/mL；(L)）或高浓度（500 μg/mL；(H)）的GlcN或COS存在下，分别处理10天（PBMCs）或4天（RAW264细胞），随后进行TRAP酶活性检测。数据以平均值±标准差表示（n = 8或4）。* p < 0.05与对照组（含RANKL和M-CSF的PBS）相比。

图3. GlcN和COS对人外周血单核细胞（PBMCs）和小鼠RAW264细胞中TRAP阳性多核细胞形成的影响。(a,b) 人正常PBMCs和(c,d)小鼠RAW264细胞分别在低浓度（0.5 μg/mL；(L)）或高浓度（500 μg/mL；(H)）的GlcN或COS存在下，用RANKL（及M-CSF）处理10天（PBMCs）或4天（RAW264细胞）。随后对细胞进行TRAP染色。在×10倍物镜下显微镜下观察到呈红色的TRAP阳性多核细胞（a,c），并统计形成的TRAP阳性多核细胞数量（b,d）。数据以平均值±标准差表示（n = 8或4）。* p < 0.05与对照组（含RANKL（及M-CSF）的PBS）相比。

五、结论与研究展望

本研究完整证实壳聚糖降解产物氨基葡萄糖、壳寡糖不会诱导破骨细胞分化，高浓度下反而能够抑制破骨细胞成熟与骨吸收相关结构形成，直接证明壳聚糖及其复合支架材料用于骨组织修复具备良好生物安全性，无需担忧材料降解加速骨流失的问题。后续研究可围绕不同聚合度、脱乙酰度壳寡糖的差异化作用开展对比，深挖氨基葡萄糖调控 O-GlcNAc 修饰抑制破骨分化的分子通路，同时开展动物体内实验验证体外细胞实验结论，评估长期植入后壳聚糖降解产物对骨重塑的长效影响，进一步拓展壳聚糖在骨科植入、牙周修复等生物材料领域的开发与临床应用。

期刊介绍

主编：Prof. Dr. Massimo Negrini

期刊发表范围涵盖生物制药领域,通过培育转基因植物、动物或水生生物来解决农业中食品的生产或质量问题，以及在医学领域中采用的新方法；在环境领域中的应用，旨在维护生物多样性并清除污染物；开发能够生产有用化学物质或销毁有害/污染化学物质的生物体或酶；生物信息学方法；以及与生物技术领域中的伦理、哲学和监管方面相关的论文。被ESCI、Scopus、PubMed、PMC等多个权威数据库收录。在JCR Biotechnology and Applied Microbiology 类别排名中位居Q2.

2025 Impact Factor：3.6

2025 CiteScore：5.6

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