论文标题：Bacterial Cytochrome P450 Involvement in the Biodegradation of Fluorinated Pyrethroids

论文链接：https://www.mdpi.com/2039-4713/15/2/58

期刊名称：Journal of Xenobiotics

期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/jox

研究背景

含氟拟除虫菊酯（如β-氯氟氰菊酯与λ-氯氰菊酯）因脂溶性与稳定性增强而具有更高的杀虫效果，但也更易在环境中持久存在并在生物组织中累积，从而带来更高的非靶标生物风险。与一般有机污染物相比，含氟化合物的碳–氟键稳定，使其微生物降解更具挑战。尽管真菌细胞色素P450在拟除虫菊酯降解中的作用已有较多报道，细菌细胞色素P450在该过程（尤其在早期关键反应）中的参与仍相对缺乏证据。本文以花园土壤微生物为来源，筛选并鉴定能够降解两种含氟拟除虫菊酯的菌株，解析其代谢途径并评估细菌细胞色素P450的参与，研究目的在于阐明β-氯氟氰菊酯与λ-氯氰菊酯的生物降解路径及关键酶系统，为含氟农药的生物修复提供依据。

研究过程与结果

研究首先以花园土壤微生物群落为起点，通过富集培养并采用19F NMR跟踪底物信号变化，观察到β-氯氟氰菊酯与λ-氯氰菊酯在24 h与48 h出现特征峰消失与新峰生成，提示发生了含氟基团相关的转化。基于该结果，研究者进一步分离菌落并在以拟除虫菊酯为唯一碳源的M9最小培养基中筛选，获得能稳定生长的菌株MFK14；全基因组测序与16S rRNA系统发育分析显示其归属于芽孢杆菌属，命名为Bacillus sp. MFK14。

图 1. 不同时间孵育下花园土壤微生物联合体对氟代拟除虫菊酯 (A) β-氰虫酰脲, 和 (B) λ-氯氰菊酯 的生物降解的 19F 核磁共振分析

图2. 在M9最小培养基上筛选菌落，该培养基补充了除碳源外仅有的拟除虫菊酯（β-氟氯菊酯和λ-氰戊菊酯）。

图3. 使用来自其他芽孢杆菌的同源16S rRNA序列对分离的芽孢杆菌MFK14进行系统发育分析

在机制解析方面，研究将Bacillus sp. MFK14与两种底物在30 ℃、200 rpm条件下孵育48 h，采用GC-MS（经MSTFA硅烷化）鉴定有机相中间体，分别检测到β-氯氟氰菊酯的13种代谢物（M1–M13）与λ-氯氰菊酯的13种代谢物（N1–N13），且两种底物的母体峰在48 h内完全消失，表明在该条件下实现完全降解。两条路径中存在共同代谢物，包括对苯二酚（M1/N3）、羟基醌（M5/N6）、4-羟基-6-氧代己-2,4-二烯酸（M6/N8）以及2-甲酰基-3-(羟甲基)-2-甲基环丙烷-1-羧酸（M9/N9），提示尽管氟化类型不同，两者在后续分解中具有共享的生物降解逻辑。与此同时，水相经冻干后进行19F NMR分析：β-氯氟氰菊酯体系检测到氟离子（δ = −122.4 ppm），λ-氯氰菊酯体系检测到三氟乙酸（δ = −75.8 ppm），作为含氟终产物被标准品对照确认。

图4. Bacillus sp. MFK14 在 β-氰戊菊酯（BCF）和 λ-氰戊菊酯（LCH）孵育 48 小时的全离子色谱图。对照实验为未加入拟除虫菊酯的细菌。由 β-氰戊菊酯产生的代谢物以“M”编号：M1–M13，由 λ-氰戊菊酯产生的代谢物以“N”编号：N1–N13。常见代谢物以绿色表示，而 BCF 和 LCH 的特定代谢物以灰色表示。

图5. 氟代拟除虫菊酯β-氰氟虫腈和λ-氰戊菊酯生物降解的常见建议途径。由β-氰氟虫腈产生的代谢物编号为“M”: M1–M13，λ-氰戊菊酯的代谢物编号为“N”: N1–N13。

为验证细胞色素P450是否参与降解，研究使用1-氨基苯并三唑（1-ABT，1 mM）进行抑制实验：预先抑制后再加入底物，GC-MS显示多数下游代谢物不再出现，仅保留早期产物；同时两种底物母体峰在48 h后仍明显存在，表明抑制细胞色素P450会显著减慢整体降解进程。进一步在无细胞裂解液中以对硝基苯乙酸酯（p-NPA）为底物进行比色实验：分别用1-ABT抑制细胞色素P450、用苯甲基磺酰氟（PMSF，1 mM）抑制酯酶，单独抑制时仍可见黄色产物形成；而双重抑制时不显色，说明细胞色素P450与酯酶两类酶系统均与酯键水解相关，并在拟除虫菊酯初始酯键断裂及后续多步转化中共同作用。基因组层面，研究对Bacillus sp. MFK14预测得到包含23个细胞色素P450变体的“CYPome”，其序列与多种已知芽孢杆菌细胞色素P450具有显著相似性，为抑制实验结论提供了遗传学支持。

图6. (A) 总离子色谱图，显示使用 1 mM 1-ABT 抑制 CYP 对 Bacillus sp. MFK14 在 48 小时孵育后降解β-氰氟虫腈（BCF）和λ-氰戊菊酯（LCH）的影响。(B) 酶抑制实验，使用 1 mM 1-ABT（CYP 抑制剂）和 1 mM PMSF（酯酶抑制剂）以 p-NPA 为底物，证明 Bacillus sp. MFK14 细胞裂解液中酯键水解的存在。该实验表明 CYP 和酯酶都能独立进行酯键水解。(C) 拟议的 CYP 在β-氰氟虫腈（蓝色框）和λ-氰戊菊酯（红色框）降解途径各步骤中的作用。

研究总结

该研究围绕两种典型含氟拟除虫菊酯β-氯氟氰菊酯与λ-氯氰菊酯，建立了从“环境样品筛选—菌株分离鉴定—代谢物解析—关键酶验证—基因组证据支撑”的完整证据链。结果显示，新分离的Bacillus sp. MFK14可在30 ℃条件下于48 h内使两种底物母体峰完全消失，并产生各13种可检测的有机中间体；其中多种代谢物在两条路径中共享，提示不同氟化形式的拟除虫菊酯在该菌株作用下可能遵循相近的骨架拆解与芳环进一步开裂逻辑。含氟终产物层面，β-氯氟氰菊酯体系检测到氟离子，指向发生了去氟相关转化；λ-氯氰菊酯体系检测到三氟乙酸，表明底物被分解为更小的含氟片段。机制上，1-ABT抑制实验显示细胞色素P450对多步反应至关重要：抑制后多数下游代谢物不再生成、底物残留显著增加；而无细胞体系的p-NPA实验进一步表明，酯酶与细胞色素P450都与酯键水解有关，双重抑制才会完全阻断反应，说明两类酶系统在初始断键及后续氧化、羟基化等转化中存在协同。结合基因组预测到的23个细胞色素P450变体（CYPome），研究为“细菌细胞色素P450参与含氟拟除虫菊酯降解”提供了实验与遗传层面的双重支持。总体而言，本文为含氟农药在环境中的微生物降解机制提供了可追踪的代谢路径与关键酶线索，也为后续围绕特定细胞色素P450功能鉴定、构建生物修复策略提供了基础框架。

期刊介绍：Journal of Xenobiotics (ISSN 2039-4713)是一个国际性、同行评审、开放获取的期刊，期刊为外源性物质以及其各方面有关的文章提供发表平台。期刊主题涵盖但不限于：外源毒素、外源药理学、环境外源性物质、内分泌干扰物、氧化应激、抗生素、生物标记物、纳米颗粒、微塑料、农药、除草剂等。期刊现已被 Scopus, ESCI (Web of Science), PubMed，PMC等多个数据库收录。