论文标题：A Flow Cytometry Protocol for Measurement of Plant Genome Size Using Frozen Material

论文链接：https://doi.org/10.3390/applbiosci4020028

期刊名：Applied Biosciences

期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/applbiosci

研究背景

流式细胞术（FCM）广泛应用于推断植物细胞核的倍性和基因组大小（GS）。传统的样品制备方法依赖于新鲜植物材料来释放完整的细胞核，但当由于物流限制无法保持植物材料新鲜时，往往会导致细胞核产量较低。以往利用冷冻植物材料进行分析的尝试主要局限于倍性分析，且依赖于切碎法，这限制了材料的投入量，并且由于细胞破碎不完全，尤其是在冷冻样品中，往往会导致细胞核产量较低。本文提出了一种改进的冷冻植物材料基因组大小估算方案，该方案能够处理更大体积的组织，同时改善碎片去除效果。通过该方案分离的细胞核也可用于DNA或RNA提取。

材料方法

选取四种植物Adenanthos sericeus var. sericeus Labill., Hollandaea sayeriana (F. Muell.) L.S.Sm., Macadamia tetraphylla L.A.S. Johnson, and Macadamia jansenii C.L. Gross & P.H. Weston用于比较新鲜和冷冻方法，这几种植物同属一个植物科，其基因组大小相差约2.5倍。新鲜和冷冻样本各设置了5个生物学重复，并进行了两种数据分析方法：碎片补偿（包括直方图建模和碎片补偿）和非补偿（包括常规直方图分析和无碎片补偿）。

研究结果

所有物种的细胞核制备方法与基因组大小数据分析方法之间的双向交互作用不显著。单因素方差分析进一步证实了不同细胞核制备和数据分析方法组合的显著性。冷冻材料的基因组大小估算结果与新鲜材料的结果相似，误差范围有所缩小，但差异并非总是显著。在某些物种中，冷冻样品可以获得比新鲜材料多得多的细胞核。通过添加特定的碎片补偿算法，变异系数 (CV%) 可以保持在 5% 以下。该方法对于评估从偏远地区采集并冷冻保存用于植物基因组测序的样本的基因组大小具有特殊价值。冷冻可以保存高质量的 DNA 和 RNA，从而使同一份样本能够同时用于流式细胞术和基因组测序。

A. sericeus	H. sayeriana

M. tetraphylla	M. jansenii

图: 比较使用不同细胞核分离和数据分析方法获得的4个物种的平均 1C 值。统计分析采用 Fisher 方差分析，并使用 Benjamini-Hochberg 错误发现率 (FDR) 校正进行事后比较。显著性水平标注如下：ns = 无显著性 (p > 0.05)，* = p < 0.05，** = p < 0.01，*** = p < 0.001，**** = p < 0.0001。

虽然该方法在所测试的四种真双子叶植物中均表现出良好的重复性，但其在富含次生代谢物的植物中的适用性可能有所不同。未来的研究应评估其在更广泛的分类群中的表现。在本研究中，细胞核在冷冻后第二天进行分析；然而，先前使用其他方案的研究表明，长时间储存会导致细胞核完整性下降。这些研究指出，细胞碎片增多、细胞核数量减少以及变异系数升高，表明长时间冷冻可能会影响数据质量。需要进一步研究以评估长时间储存对细胞核质量、变异系数和荧光信号稳定性的影响。此外，还可以进一步研究如何优化裂解缓冲液以减少细胞碎片含量。

结论

本研究通过统计分析表明，采用优化方案处理冷冻植物组织后，其基因组大小（GS）估计值与新鲜材料无显著差异。此外，引入碎片补偿可有效降低细胞核碎片和细胞屑的干扰，将变异系数维持在可接受范围内，并最大限度地减少荧光干扰，从而提升GS估计的准确性。尽尽管并非始终具有统计学意义，但碎片补偿也降低了标准误差，表明GS估计的精确度有所提高。这一进展拓宽了流式细胞术在基因组研究中的应用，尤其适用于在偏远或后勤受限的环境中采集样本的情况。该方案对于需要同时进行基因组大小测定和后续DNA测序的双重目的工作流程也具有重要意义。通过对不同分类群和不同保存时间进行进一步验证，该方法有望显著推动基于野外和保护基因组学的研究工作。