论文标题： Recent technology advancements in large-scale DNA assembly

期刊：Quantitative Biology

作者：Jielin Li, Li Cheng, Yingxin Ma, Yizhi Cai, Junbiao Dai

发表时间：17 December 2024

DOI： https://doi.org/10.1002/qub2.79

微信链接：点击此处阅读微信文章

DNA大片段组装是合成生物学界的一项重要技术，它赋能了生物基因组的大规模修改与定制化合成。从数千碱基的病毒基因组，到上兆碱基的酵母基因组，DNA大片段组装的能力决定了人工合成基因组的上限，进而限制了人造生命领域的发展。因此，DNA大片段组装具有重大研究意义与应用价值。

近期，中国科学院深圳先进技术研究院戴俊彪课题组在Quantitative Biology期刊发表了一篇题为"Recent technology advancements in large-scale DNA assembly"的评论文章。该文系统回顾了体内DNA大片段组装技术的发展历程，详细分析了不同底盘细胞中DNA大片段组装策略的特点，包括不同组装策略的组装极限、耗时以及优缺点，同时指出了未来DNA大片段组装的发展方向和潜在应用场景。

全文概要

过去20年间，DNA合成与组装技术取得了飞速进展，产生了适用于不同规模的多种组装技术。相较于体外组装技术存在的工作量大及长度限制等问题，基于同源重组的体内组装成为了构建大片段DNA的主要手段。目前，体内组装主要依赖于三种模式生物底盘：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及酿酒酵母。本文作者基于这三种常用的底盘生物，总结了目前大片段DNA组装的前沿策略（图1）。

图1 基于同源重组的DNA大片段组装策略

基于大肠杆菌底盘的组装策略

大肠杆菌作为一种广泛应用的模式生物，具有遗传背景清晰、繁殖周期短等优点。通过利用Lambda-red系统，研究者已经开发出一系列克服兆碱基大小DNA片段构建障碍的系统。其中，JasonChin团队开发的REXER和CONEXER系统，结合CRISPR/Cas9技术，成功实现了在大肠杆菌中组装1.1 Mb大小的人类基因组片段。

基于枯草芽孢杆菌底盘的组装策略

枯草芽孢杆菌具有极高的基因转化能力，可以通过RecA介导的同源重组高效地整合外源DNA。目前，在这一底盘菌株中组装大片段DNA的主要策略有两种：尺蠖伸长法（IWe）和多米诺骨牌法（The dominomethod）。这些方法已成功应用于组装来自光合细菌的3.5 Mb外源DNA以及真核生物的线粒体和叶绿体基因组。然而，这两种策略也存在一定的局限性，例如需要高质量的DNA模板等，这限制了它们在从头组装中的应用。

基于酿酒酵母底盘的组装策略

酿酒酵母因其成熟的遗传工具箱和高效的重组能力，成为DNA大片段组装中最常用的平台之一。它已被证明能够耐受较大的染色体片段。目前，在酿酒酵母中，已有多种重组方法被广泛应用，包括仅利用同源臂设计实现的转化相关重组方法TAR、通过营养缺陷型交替实现的染色体组装方法SWAP-In和eSWAP-In，以及基于酿酒酵母交配-减数分裂的组装方式MRA等。此外，YLC组装技术将酵母交配-孢子形成与CRISPR/Cas系统结合，实现了95 kb酵母必需基因片段的组装。酿酒酵母在动植物基因组合成领域展现出巨大潜力，已被应用于多个合成人工基因组项目，包括小粒碗藓基因组合成计划（SynMoss）也正基于该平台展开。

未来应用前景：

合成基因组学领域正在快速发展，目前已成功实现几种单细胞生物体的从头染色体合成，并涌现出多种新兴的DNA合成与组装策略。然而，由于多细胞生物体的染色体规模庞大且结构复杂，其合成仍面临诸多挑战。这些挑战主要包括高GC含量和多重复序列的DNA合成，以及超大片段DNA的精确组装与递送，这些问题都对组装的成本与准确性提出了严峻考验。酶促DNA合成以及天然DNA片段的利用可能是解决上述问题的有效途径，有助于以低成本构建更复杂的生物体染色体。DNA组装技术的进步为各个研究和应用领域提供了广阔的机会，特别是在从头合成与组装基因组方面，可能有助于揭示遗传元件的功能、实现生物工程化改造，并为构建疾病模型开辟了新的可能性。

QB期刊介绍

Quantitative Biology （QB）期刊是由清华大学、北京大学、高教出版社联合创办的全英文学术期刊。QB主要刊登生物信息学、计算生物学、系统生物学、理论生物学和合成生物学的最新研究成果和前沿进展，并为生命科学与计算机、数学、物理等交叉研究领域打造一个学术水平高、可读性强、具有全球影响力的交叉学科期刊品牌。

《前沿》系列英文学术期刊

由教育部主管、高等教育出版社主办的《前沿》（Frontiers）系列英文学术期刊，于2006年正式创刊，以网络版和印刷版向全球发行。系列期刊包括基础科学、生命科学、工程技术和人文社会科学四个主题，是我国覆盖学科最广泛的英文学术期刊群，其中12种被SCI收录，其他也被A&HCI、Ei、MEDLINE或相应学科国际权威检索系统收录，具有一定的国际学术影响力。系列期刊采用在线优先出版方式，保证文章以最快速度发表。

中国学术前沿期刊网

http://journal.hep.com.cn