导读

三维结构光照明显微成像技术（3D-SIM）能够实现亚细胞结构的三维可视化与纳米级分辨率重建，在生命科学研究中得到广泛应用。然而，该技术在实际应用会受到光学像差、荧光密度异质性等因素的影响，导致照明参数估计不准确，从而影响图像重建质量。近日，南京理工大学陈钱、左超教授团队提出了一种基于主成分分析的三维结构光照明显微成像方法（PCA-3DSIM）。该方法将主成分分析（PCA）从二维拓展至三维成像领域，并结合自适应局部分块策略进行精确参数估计与干扰抑制，实现了高质量的三维超分辨图像重建。实验表明，该方法在自研系统与商用平台中均展现出良好的成像性能与适配能力，为3D-SIM在复杂生物样品中的推广应用提供了有力支撑。相关研究成果以“Principal component analysis for three-dimensional structured illumination microscopy (PCA-3DSIM)”为题发表于国际顶尖学术期刊《Light: Science & Applications》。

研究背景

在生命科学研究中，以纳米级分辨率实现细胞及亚细胞结构的三维可视化，对于深入理解细胞机制、疾病演化及药物作用过程具有重要意义。三维结构光照明显微技术（3D-SIM）凭借其优异的轴向分辨能力、低光毒性及对常规荧光染料的良好兼容性等优势，在活细胞动态成像和细胞器交互研究中得到了广泛应用。然而，3D-SIM的重建质量高度依赖于照明参数的精确提取。现有主流算法普遍假设照明参数在整个视场内保持恒定，并基于调制最优的图像层或其合成层进行参数估计。然而，在实际成像中，光学像差、荧光密度异质性、调制度非均衡等因素会导致照明参数在三维体积空间内产生复杂的局部扰动，破坏了空间一致性假设，从而影响重建保真度。

为缓解上述问题，近年来研究者引入更先进的计算方法以提升重建精度。该研究团队此前提出了基于主成分分析的结构光照明显微成像方法（PCA-SIM），有效提升了二维成像中照明参数估计的精度与鲁棒性。该成果发表在eLight期刊，入选ESI高被引论文，并被评为“2023年中国光学十大社会影响力事件”。然而，将该方法推广至3D-SIM，需应对更高维度的数据结构以及体积空间内照明参数变化带来的额外复杂性。

研究亮点

研究团队在PCA-SIM的基础上，提出了结构光照明模型的张量（Tensor）分析方法。在3D-SIM中，照明相量可表征为一个三阶张量。研究发现，在理想无干扰条件下，该照明张量在任意模态下的Tucker秩均为1，即其mode-n展开矩阵均呈现秩-1的低秩结构，反映出数据在多维空间中存在高度相关性与显著冗余。换言之，理想照明张量仅由一个“外积因子”构成，各模态展开矩阵的列空间仅包含一个“主成分”，其在最小二乘意义下集中于一个单一维度的“特征子空间”；而实际成像中，噪声、像差等干扰因素则表现为不规则的高维分量。值得注意的是，消除这些高维干扰分量以提取由照明参数主导的外积因子/主成分，恰好与PCA（这里指高阶PCA）的核心思想高度契合。基于此，研究人员利用PCA的降维特性与特征解耦能力，对实验获取的照明张量进行Tucker分解并提取各模态下的第一主成分，从而准确还原出结构化光场的亚像素级波矢量与初相位）。此外，针对照明参数空间非均匀性问题，研究人员提出了一种自适应局部分块重建策略，通过对局部区域进行基于PCA的参数独立优化，进一步提升了3D-SIM的图像重建质量。

为评估PCA-3DSIM在复杂成像条件下的稳健性，研究人员通过在理想三维结构光照明场中引入逐像素波矢偏移及层间轴向位移，以模拟实际成像过程中的空间照明参数扰动（图1a-1c）。在此基础上，分别采用PCA-3DSIM与先进的开源重建框架Open-3DSIM⁶进行重建对比。仿真结果显示，由于Open-3DSIM依赖于全场一致的照明参数假设，其重建图像中存在一定程度的伪影。相比之下，PCA-3DSIM能够准确提取局部照明主成分，显著抑制伪影产生，重建图像在空间分辨率与结构保真度方面更接近于理想参考图（图1d-1j）。

图1. 照明参数随体积空间变化情况下的仿真对比结果。a, b 仿真的三维结构光照明场；c 沿图b中蓝色虚线处的强度剖面图；d-g 不同方法（Open-3DSIM⁶和PCA-3DSIM）获得的宽场图像与超分辨图像；h 沿图e-g中蓝线处的强度剖面图；i, j 不同方法所得超分辨图像与真实图像间的结构相似性指数（SSIM）与峰值信噪比（PSNR）。

随后，研究人员进一步验证了PCA-3DSIM在自研系统中的适用性。针对该系统固有的照明参数波动及系统误差问题，PCA-3DSIM通过对局部照明特征的精准建模与校正，实现了相较于对比方法更高的空间分辨率及更优的光切片能力（图2a-2e）。定量分析表明，PCA-3DSIM获得的横向和轴向平均分辨率分别达到95.83 nm和296.95 nm，优于对比方法所获得的98.22 nm与298.04 nm，验证了其在低稳态系统中的鲁棒性和成像精度优势（图2f-2h）。此外，研究人员进一步在商业化Nikon N-SIM平台上对PCA-3DSIM进行了扩展验证（图3）。实验结果显示，PCA-3DSIM仍展现出稳定的重建性能，证明了其良好的系统兼容性与实际应用潜力。

图2. 在自研系统下对HeLa细胞样本进行的超分辨成像对比实验。a-e 宽场图像与不同方法获得的超分辨图像；f 图c-e中沿黄色线的强度剖面图；g 特定层超分辨图像的PANEL评估对比图；h 不同方法获得的三维超分辨图像堆栈的PANEL值与rFRC值分布对比。

图3. 在Nikon N-SIM平台下对COS-7细胞样本进行的超分辨成像对比实验。a-d 宽场图像与不同方法获得的超分辨图像；e 图b-d中沿蓝色线的强度剖面图；f 特定层中沿x方向分块图像的横向波矢分布，以及某一横向位置在不同层中的波矢分布；g 特定层超分辨图像的rFRC图及三维图像堆栈的rFRC值分布、平均分辨率分布与对比度分布；h PCA-3DSIM获得的不同层超分辨图像切片及其整体三维视图。

总结与展望

本研究提出了一种基于主成分分析的三维结构光照明显微成像技术（PCA-3DSIM），通过将主成分分析方法拓展至三维超分辨成像，并结合自适应局部分块重建策略，有效应对了光学像差、荧光密度异质性等因素引起的照明参数空间不一致问题，实现了高保真、低伪影的三维重建效果。仿真和实验结果均表明，该方法具备优异的通用性和鲁棒性，适用于多种成像平台。为进一步增强其实用性，未来工作将重点优化算法结构与计算速度，实现更高效的三维超分辨成像能力，为活细胞动态过程监测与生命科学研究提供有力支撑。（来源：LightScienceApplications微信公众号）

相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41377-025-01979-8