2016年1月，回国不满半年的张余，在《中国科学院分子植物科学卓越创新中心人员遴选申请书》里写到：“申请人拟开展的工作是运用结构生物学研究叶绿体编码的RNA聚合酶（PEP）的工作机理和调控机制。”

8年后，张余团队和华中农业大学副教授周菲团队合作，解析了PEP的冷冻电镜结构，并揭示了该叶绿体基因转录“机器”的“装配部件”“装配模式”“功能模块”，为叶绿体光合作用的基础研究和应用探索打下了基础。2024年3月1日，相关研究成果以封面文章形式发表于《细胞》。

文章封面图 受访者供图（下同）

“植物学领域的前沿科学问题，很多都是生命科学的共性问题。”中国科学院院士、中国科学院分子植物科学卓越创新中心（以下简称分子植物卓越中心）主任韩斌告诉《中国科学报》，这项工作填补了RNA聚合酶（RNAP）领域的空白，是可以写进教科书里的突破性进展，将带动后续一系列应用上的探索。

领域里最有挑战性的难题

如果将细胞比喻为一台精密运转的电脑，基因转录机器——RNAP则是转录过程中的“中央处理器（CPU）”，其重要性不言而喻。“遗传信息被存储在了基因组这块‘硬盘’中，必须借助于CPU读取细胞中的各类数据，并经过整合各方信号输出指令，才能开始后续的生命活动。”张余解释。

随着对此类“CPU”认识的不断深入，人们惊奇地发现，尽管生物种类众多，RNAP却十分保守。

几十年间，人们陆续解析了细菌、古菌、真核生物RNAP的结构和工作机制。但对植物特有RNAP的解析则进展缓慢，一直到近几年，植物特有的Pol IV的结构和机制才被阐明——这项工作由张余以及分子植物卓越中心研究员王佳伟合作完成。

而PEP的构造迟迟不现“庐山真面目”，事实上，光对其进行鉴定发现，就足足经历了32年时间。

原因在于其结构过于复杂。“这是一个持续发现的过程。可能这一年发现某一蛋白是RNAP的亚基组分，过两年又发现了一个。”张余介绍。

植物叶绿体的“祖先”是原核蓝细菌，在15亿年的演化时间里，蓝细菌基因组基因不断被转移至细胞核，同时细胞核基因也不断加强对叶绿体的调控。

演化至今，叶绿体基因组变得“小而精”，转录叶绿体基因组的机器却越发复杂。PEP在原核蓝细菌基因转录机器的基础上，装配了多个独特的功能模块，“身形”变为原来的2.5倍，其“装配部件”数量变为原来的3倍。然而这些模块在原核蓝细菌中却基本没有任何“原型”，大多数“借”于真核细胞。

多年研究表明，叶绿体基因转录机器控制叶绿体的发育过程以及成熟叶绿体的基因表达，在调控植物光合作用中发挥关键角色。“可以认为，PEP是领域内最重要、最有挑战性的难题。”王佳伟介绍。

科研是一场没有硝烟的竞争

回国后的八年间，张余和他的团队，聚焦于细菌、酵母和植物的细胞核与细胞器RNAP，并持续有成果产出。

但PEP的结构解析，在很长的一段时间里都没有进展。

“最大的瓶颈是如何从叶绿体中纯化丰度非常低的RNA聚合酶，我们尝试了多种手段，都以失败告终。”张余回忆，“比如我们沿用解析Pol IV时的一个方法，用拟南芥悬浮细胞去纯化植物内源蛋白，但目前拟南芥中叶绿体转化的效率非常低，很难把稳定的蛋白标签插入到叶绿体的基因组中。”

2019年，德国马普分子植物生理所所长、德国科学院院士Ralph Bock在分子植物卓越中心进行学术报告，介绍了他实验室在植物质体转化技术和应用领域的研究进展。

张余茅塞顿开，意识到可以在PEP的基因序列中加上一段DNA序列作为标签，再通过亲和纯化的方式，把PEP从复杂的组分中“拉”出来，从而获得叶绿体基因转录蛋白质复合物。

团队锁定了叶绿体基因转化效率较高的模式植物大叶烟草，又遇到了新的挑战。“前期我们没有种植烟草的经验，刚开始种植的时候就遇到了‘蚜虫灾害’，烟草一直长不大，我们就天天用透明胶带手工捕捉蚜虫。最后通过对温室和培养土进行灭菌，进行了根治。”文章一作、分子植物卓越中心副研究员武霄仙介绍。

张余与文章第一作者武霄仙（左）、穆文慧（右）合影

一直到2022年年底，团队才建立了稳定的纯化流程，突破了PEP蛋白获取的瓶颈。与此同时，国际上的竞争十分激烈，陆续有几个课题组在PEP纯化及结构解析方面取得了突破。

“我们当时很紧张。”为了确保进度，武霄仙还没休完产假就回实验室投入了这项研究，经常做实验做到半夜。“我的家里人也非常支持我的工作，能帮我照顾孩子、处理家中琐事。”

此外，PEP复杂的结构也为数据处理带来了挑战。在获得蛋白冷冻电镜结构后，武霄仙发现PEP蛋白的二维分类中存在很多“洞”和“犄角”，三维结构也很陌生。“文献报道PEP由蓝细菌RNAP进化而来，但是我一点都找不到蓝细菌RNAP的‘影子’，一度以为自己解析了一个‘杂蛋白’。”

最终，团队从较为熟悉的亚基入手，并基于前期文献和AlphaFold结构预测，将PEP亚基放置到了准确位置，并很快开始了论文撰写。

2023年6月，英国Michael Webster课题组在会议中报告了白芥PEP蛋白冷冻电镜结构的相关进展，最后两个课题组商量“背靠背”共同发表。

“在这八年多时间里，我们之所以能够一直坚持下去，得益于中心营造的比较宽松、让青年人才能够潜心去啃硬骨头的一个氛围。”张余强调。

补上最后一块拼图

与原核蓝细菌基因转录机器相比，PEP一共具有20个“装配部件”（蛋白亚基），其中14种是其特有的。

研究团队发现，这些“部件”通过“套娃模型”进行装配：蓝细菌来源的催化模块包含6个“装配部件”，位于复合物的核心层；支架模块由7个部件组成，位于中间层，一方面可以稳定催化模块，另一方面为其他模块提供结合位点；另有7种部件位于最外层，具有不同的功能特性。

在“套娃”最外层，分布着3个不同模块。保护模块包括2个蛋白亚基，它们具有超氧化物歧化酶的功能，保护PEP免受叶绿体中超氧化物的氧化攻击；RNA模块包括1个亚基，能够序列特异性地结合RNA，推测可能参与转录关联的RNA加工过程；调控模块则由4个亚基组成，可能参与基因转录机器的活性调控。

叶绿体基因转录机器构造

其中，催化模块由叶绿体基因组编码，蛋白亚基起源于蓝细菌；其他模块由细胞核基因组编码，大部分蛋白亚基起源于真核细胞，在细胞质翻译后运输至叶绿体完成组装。

“这是一个非常巧妙的组装模式，能够保证细胞核控制叶绿体的基因表达。”张余解释，“这些亚基需要在细胞核中完成转录、在细胞质中完成翻译，再运输到叶绿体中，同催化模块组装成完整的复合物，此时PEP才能够发挥功能。”

张余指出，叶绿体基因转录机器结构的解析，意味着三域生物所有RNA聚合酶的结构类型均被阐明，“最后一块拼图”终于被补上。

在基础研究层面，这项研究为进一步探索叶绿体基因转录机器的工作模式、理解叶绿体的基因表达调控方式打下了基础。

在应用层面，则为改造叶绿体基因表达调控网络、增加光合作用复合物的基因表达、提高光合作用效率打下了基础。比如通过提高光合作用基因表达增加作物生物量，进而提高产量；提高植物的光合作用，理论上可以提高植物固定二氧化碳的能力，增加植物碳汇；合成生物学应用层面，则为植物叶绿体生物反应器的效率提升提供了着手点，可助力重组疫苗、重组蛋白药物、和天然产物的生产。

但对于这一进展，张余非常谦虚。“我觉得我们只是把研究叶绿体基因转录领域的门推开了。在整个转录过程中，还有很多其他蛋白和小分子的参与，需要在多个层面进一步研究。”（来源：中国科学报 江庆龄）

相关论文信息：http://doi.org/10.1016/j.cell.2024.01.026