论文标题：METAGENOMICS COMBINED WITH HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING REVEALS THE METHANOGENIC POTENTIAL OF FRESH CORN STRAW UNDER THERMOPHILIC AND HIGH OLR(结合宏基因组学与高通量测序揭示高温高负荷条件下新鲜玉米秸秆产甲烷潜力)

期刊：Frontiers of Agricultural Science & Engineering

作者：Jinzhi HUANG, Xiaoting YAN, Zhen LIU, Mengyi WANG, Yangyang HU, Zhenyu LI, Minsong LIN, Yiqing YAO

发表时间：15 Sep 2023

DOI：10.15302/J-FASE-2022471

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畜禽废弃物资源化与碳中和

Valorization of Livestock Waste and Carbon Neutrality

专 辑 文 章 介 绍

· 第五篇 ·

▎论文ID

Metagenomics combined with high-throughput sequencing reveals the methanogenic potential of fresh corn straw under thermophilic and high OLR

结合宏基因组学与高通量测序揭示高温高负荷条件下新鲜玉米秸秆产甲烷潜力

发表年份：2023年

第一作者：黄金芝¹，闫小婷²

通讯作者：林民松³，姚义清^1,4

：linms@caep.org.cn, dzhtyao@nwafu.edu.cn

作者单位：1. 西北农林科技大学机械与电子工程学院；2. 西北工业大学生态与环境学院；3. 中华人民共和国生态环境部中国环境规划研究院；4. 西北农林科技大学农业部西北农村可再生能源开发利用研究中心。

Cite this article :

Jinzhi HUANG, Xiaoting YAN, Zhen LIU, Mengyi WANG, Yangyang HU, Zhenyu LI, Minsong LIN, Yiqing YAO. METAGENOMICS COMBINED WITH HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING REVEALS THE METHANOGENIC POTENTIAL OF FRESH CORN STRAW UNDER THERMOPHILIC AND HIGH OLR. Front. Agr. Sci. Eng., 2023, 10(3): 403–423 https://doi.org/10.15302/J-FASE-2022471

· 文 章 摘 要 ·

干玉米秸秆（Dry corn straw, DCS）通常以干物质状态用于厌氧消化（anaerobic digestion, AD），但鲜玉米秸秆（fresh corn straw, FCS）很少涉及。本工作研究了高温条件下单一底物（FCS或DCS）及两种状态秸秆分别与牛粪混合厌氧消化的特性。结果表明，FCS单底物厌氧消化的甲烷产率144 mL·g⁻¹·VS⁻¹，比DCS单底物和FCS加牛粪混合厌氧消化高7.5%和19.6%。FCS结构疏松，比DCS更易降解，利于甲烷快速生成。在发酵系统的水解和酸化阶段，Clostridium_sensu_stricto_1, Clostridium_sensu_stricto_7和Sporosarcina促进有机质分解，导致挥发性脂肪酸（VFAs）积累，而丰度高达54.4%的甲烷八叠球菌（Methanosarcina）激活多功能产甲烷途径，从而避免VFAs对反应系统的抑制。通过探究发现消化系统主要编码甲酰甲烷呋喃脱氢酶（K00200-K00203）和四氢甲烷蝶呤S甲基转移酶（K00577-K00584）基因，通过抗逆性强的氢营养途径产甲烷。与此同时，甲烷八叠球菌还分别编码乙酰磷酸（K13788）和甲基辅酶M还原酶（K04480，K14080和K14081）基因，激活了乙酸营养和甲基营养产甲烷途径。为了避免单底物厌氧消化发生的酸抑制影响新鲜秸秆产甲烷效率，本研究进一步将其与牛粪混合消化，在缓冲性能较好的系统中证实了FCS具有更高的产甲烷潜力。本研究提出的思路和结论为高效利用农作物秸秆产甲烷提供了新的途径与科学依据。

· 文 章 亮 点 ·

1. 鲜玉米秸秆产甲烷效率比干秸秆高7.50%。

2. 鲜玉米秸秆的结构更有利于降解。

3. 鲜玉米秸秆的有机成分比干秸秆丰富、含量高。

4. Clostridium_sensu_stricto_1, Sporosarcina和甲烷八叠球菌在厌氧发酵过程中发挥主导作用。

5. 宏基因组学揭示甲烷八叠球菌通过多种产甲烷途径适应高VFA胁迫。

· Graphical abstract ·

· 研 究 内 容 ·

▎引言

世界正面临环境污染和能源短缺等多重压力，迫使各国寻求新技术来产生可再生能源，从而减少对煤炭、汽油和合成气等现有能源的依赖。可再生能源以其清洁、无污染、可再生等优点受到世界各国的青睐。在各种可再生能源中，生物质资源约占60%。生物质原料种类繁多，包括农作物残留物（如秸秆）、林业废弃物和城市固体废弃物。作物秸秆作为一种潜在的可再生能源最近受到了广泛的关注，由纤维素、半纤维素和木质素组成，结构交联复杂，难以被微生物有效降解。研究高效、稳定、安全的秸秆转化为可再生能源的方法，具有重要意义。当前的应用实践中主要以DCS作为厌氧发酵原料，而FCS更易降解、有机物质组成丰富且含量高，需要对其甲烷生产潜力和相关的能量转化机制深入探索和综合评价。本研究以FCS和DCS作为高固体含量厌氧消化（high solid anaerobic digestion, HS-AD）的底物，对其甲烷生产潜力、结构特征、中间代谢产物和微生物代谢进行了研究和比较。为充分发挥两种秸秆的甲烷生产潜力，进一步将秸秆与牛粪共消化，以平衡单底物厌氧消化发生的酸抑制带来的影响。本研究为建立科学合理利用农作物秸秆能源转换策略提供技术和理论依据。

▎新鲜玉米秸秆（FCS）比干玉米秸秆（DCS）具有更好的甲烷生产潜力

结果表明，FCS系统具有较高的甲烷产率（图1）。实验结果表明FCS更大程度地保留了有机化合物。FCS发酵体系中纤维素和半纤维素降解率明显高于DCS发酵体系，这是由于FCS中较高的有机化合物浓度为微生物的代谢提供了充足的营养源。因此，FCS系统的甲烷生产潜力高于DCS系统。与牛粪的混合发酵体系中，由于秸秆自身有机质含量高于牛粪，在一定的反应体积和底物浓度条件下，牛粪的加入降低了反应体系中可利用有机物总量，从而导致FCS和牛粪混合发酵效率低于FCS单底物发酵。

图1 产甲烷过程。(a) 日CH₄产量；(b) CH₄百分含量；(c) 累积CH₄产生量。

▎特殊物理化学性质与微观结构决定FCS具有较高的甲烷生产潜力

如图2所示，扫描电子显微镜（SEM）分析表明FCS表面起皱粗糙且不均匀，而DCS表面纹理饱满且整齐。在FCS生产过程中，秸秆内部多余水分直接升华，水冰结晶表面有褶皱和卷曲，但孔隙和裂隙结构保留下来，导致物理结构疏松多孔。而DCS的自然脱水过程导致组织收缩和细胞塌陷变形。因此FCS更易被微生物降解，从而有效地增强甲烷生产过程。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析说明二者木质素与组分中化学基团基本不变，表明其不是引起FCS和DCS甲烷产生差异的主要因素。此外，力学性能分析表明DCS的分子间结构更致密，张应力大，分子结构不易被破坏。而FCS的结构比较松散，分子间聚合度不高，说明其纤维结构更易消解，这是FCS具有较高的甲烷生产潜力的重要原因。

图2 表面微观结构变化的结果。(a) 新鲜玉米秸秆的SEM图像 (×1000)； (b) 干燥玉米秸秆的SEM图像 (×1000)；(c) 玉米秸秆的FTIR谱图。

▎厌氧消化性能和中间代谢物

为揭示FCS和DCS的高固体含量厌氧发酵（HS-AD）系统之间CH₄产量差异的内在原因，通过VFAs、pH、TAN和FAN分析AD的性能（图3），在厌氧发酵过程中pH值低于大多数产甲烷菌的适宜pH值范围（6.8–7.5）将会导致系统短期酸化。随着发酵反应进行，HS-AD系统发挥自身调节作用，酸化现象逐渐减轻。结果表明，各HS-AD消化体系中挥发性脂肪酸的主要组成为乙酸，其次为丁酸和丙酸。本研究中，无论是单底物还是混合消化，与DCS相比，FCS都存在短暂的酸化现象，影响了CH₄的产生，并导致峰值时间滞后。此外，与DCS相比，较高浓度的VFAs作为FCS中的主要前体有助于更高的产甲烷潜力。实验结果表明，FCS厌氧消化系统对有机物的降解率较高，推断FCS系统粗蛋白、小分子有机酸等微生物代谢产物的浓度高于DCS系统，利于CH₄生产效率。

图3 中间代谢物的分析。(a) VFA，T1和T2；(b) VFA、T3和T4；(c) TAN；(d) FAN;（e）稳定期的3D-EEM;（f）末期的3D-EEM。

▎微生物进化趋势

通过研究HS-AD稳定期和末期细菌群落的组成和多样性，与FCS系统相比，DCS系统的细菌群落多样性较高但其细菌功能表达受到抑制。其中，厚壁菌门等细菌与其他菌群在AD中具有明显协同作用，促进中间代谢产物的产生和代谢，为产甲烷提供了条件。由于DCS系统中相关细菌相对丰度较小，从而影响了中间代谢产物的转化，致使产甲烷活性降低。通过关联网络分析和功能预测发现主要的产甲烷菌依次是甲烷八叠球菌、甲烷球菌、甲烷短杆菌和甲烷嗜酸球菌。

▎宏基因组分析

基于以上四组HS-AD中间代谢产物和微生物群落组成的分析，优势物种的微生物相互作用和代谢途径可能存在显著差异。对于每组宏基因组，编码代谢功能的基因占主导地位，在单底物AD中，最丰富的代谢类型是碳水化合物代谢。而FCS系统中参与碳代谢和CH₄转化、核苷酸代谢、聚糖生物合成和代谢的基因相对高表达，促进CH₄产生。并且结果表明FCS的HS-AD系统中存在更多的氢营养途径。甲烷八叠球菌等菌属几乎含有氢营养途径的所有酶，倾向于利用H₂和CO₂合成CH₄，甲烷八叠球菌具有将甲醇和甲胺转化为CH₄的能力。此外，本研究发现一类甲烷曲霉菌属含有用于完整甲基营养途径的所有酶，表明其可通过甲基营养代谢途径产生CH₄。

· 结 论 ·

本研究证实了FCS厌氧消化系统的甲烷产率（144 mL·g⁻¹·VS⁻¹）比DCS高7.5%。与DCS发酵系统相比，首先，FCS的表面结构更利于纤维素降解；其次，挥发性固体、粗蛋白质浓度和纤维素降解率较高，与CH₄产生潜力呈正相关；第三，前述两个特征指标与HS-AD过程中微生物的代谢活动密切相关。厚壁菌门的Clostridium_sensu_stricto_1 和 Clostridium_sensu_stricto_7等与其它细菌通过协同代谢关系，促进反应系统的酸化。产甲烷菌以乙酸型、氢型、甲基型等多种营养途径的协同方式适应高酸性环境，能及时将中间产物转化为CH₄。甲烷八叠球菌属兼具多种营养途径，主要通过氢营养型产甲烷途径发挥主导作用，有效避免了VFAs过量积累对CH₄生成过程的抑制。本研究表明，在高温、高OLR条件下，采用单底物FCS是一种较为合理的方式，为作物秸秆高效厌氧产CH₄提供了重要调控依据。

美编 | 冯晨晨

编辑 | 唐静月 李云舟

审稿 | 许建香

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