华南农业大学生命科学学院教授刘耀光院士团队提出了一种利用微同源介导的末端连接修复(MMEJ)的方式促进CRISPR/Cas9的植物基因组大片段删除新策略。相关研究近日在线发表于《植物生物技术杂志》。

CRISPR/Cas9系统进行基因组切割导致DNA双链断裂，常通过非同源末端修复（NHEJ）的方式，在靶位点处产生一个或几个碱基的插入或缺失，以达到基因功能敲除的目的。然而，这一类突变往往会使基因产生不正常的转录本或异常效应蛋白。因此，对目标基因进行大片段删除将有助于真正实现编码或非编码基因的功能研究。

研究人员通过对已有水稻基因编辑群体（靶点设计未事先考虑微同源序列）的基因组片段删除大小的分析，发现MMEJ的修复方式比NHEJ修复方式能更有效地促进植物基因组大片段的删除。为了验证这一发现，研究人员选择了一个转基因水稻材料中的潮霉素抗性基因（HPT）表达盒作为删除目标，利用其开发的微同源搜索程序RepFinder找到HPT表达盒两侧的5—7个碱基的微同源序列；再利用其开发的基因组编辑综合在线工具CRISPR-GE设计尽量靠近微同源序列的编辑靶点。

研究人员通过构建多基因编辑载体并再转化上述转基因水稻，最终在编辑植株中获得了66.7%的HPT表达盒删除的植株，其中预期的MMEJ介导的删除效率高达52.4%，而NHEJ介导的删除效率仅为14.3%。进一步分析发现影响MMEJ介导基因组片段删除效率主要有三个方面：切割位点距离微同源序列较近将有助于片段删除；微同源序列的长度对MMEJ介导基因组片段删除效率的影响并不显著；使用多个靶点同时产生多个DNA双链断裂点可能会增加基因组片段缺失的频率。

该研究为植物功能基因组学的发展和作物遗传改良应用，提供了有力的研究工具。

相关论文信息：https://doi.org/10.1111/pbi.13390