作者:LIU Ying 来源:《中国科学》 发布时间:2013-3-13 10:55:56
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研究发现单管多重PCR检测多个位点新方法
 
来自暨南大学理工学院,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所的研究人员针对乳腺癌位点:rs4784227(C>T), rs1219648(G>A)和 rs3803662(T>C),利用一种简单方法,获得三个位点的分型结果,建立了单管多重PCR同时检测这些位点的新检测方法。这一研究成果公布在《中国科学—生命科学》(Scientia Sinica Vitae)杂志上。
 
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。已有研究表明, 易感基因 FGFR2(fibroblast growth factor receptor 2)和 TNRC9(the trinucleotide repeat containing 9)的变异对 ER+(estrogen receptor-positive)乳腺癌的影响明显。TNRC9基因上的 rs4784227(C>T)多态是基于中国女性筛选出的易感位点,rs1219648(G>A)和rs3803662(T>C)分别为 FGFR2与 TNRC9基因的主要研究对象,是导致中国女性乳腺癌恶性程度加深的遗传因子。因此针对这3个位点建立多重检测方法具有临床应用价值,可作为乳腺癌高危人群预防和早期治疗的参考依据。
 
在近年来出现的多种单核苷酸多态性SNP检测技术中,四引物扩增受阻突变体系 PCR(tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, T-ARMS-PCR)或两对交叉引物 PCR(PCR with confronting two-pair primers, PCR-CTPP)因其操作简便、分型快速、费用低廉而被广泛应用。
 
这种方法的原理为针对已知的突变, 在突变点的两侧分别设计一对外引物和一对特异性内引物, 特异性内引物用来检测突变是否发生, 外引物在PCR 反应中和特异性内引物配对, 从而选择性地扩增突变型与野生型个体基因。特异性内引物的设计保证了在同一次扩增中野生型和突变型基因产生的扩增片段长度不同, 因此可以通过产物电泳图谱中特定条带的有无判别个体的基因。
 
但是目前T-ARMS-PCR方法仍以单重检测为主, 少数实验室也能实现多重检测(Multiplex-T-ARMS-PCR, M-T-ARMS-PCR), 但其可同时检测的位点数量难以进一步提高, 主要受到两个限制——多重扩增的偏向性及琼脂糖电泳的分辨率。
 
在这篇文章中,研究人员通过引入多重嵌合引物PCR技术对T-ARMS-PCR进行了改进, 在扩增初期使用特异性嵌合引物(即在特异性引物 5′端引入通用序列)扩增, 而扩增末期由通用引物引发扩增, 从而在保证反应特异性的同时, 降低了多重PCR 的偏向性。
 
此外, 研究人员还应用分辨率较高的毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)替代琼脂糖电泳, 建立了单管多重 PCR 同时检测乳腺癌相关位点rs4784227 (C>T), rs1219648(G>A)和 rs3803662(T>C)的三位点检测方法。
 
采用T-ARMS-PCR 方法进行SNP分型, 仅需一次PCR扩增和一次琼脂糖电泳即可达到目的。这项研究采用嵌合引物扩增和毛细管电泳对T-ARMS-PCR进行改进, 建立了一种M-T-ARMS-PCR的SNP分型方法。
 
并且这项研究也在成功对全血样品进行分型的基础上,通过进一步优化实验条件实现了对浓度更低的口腔拭子样本的准确分型。在18份口腔拭子DNA标本通过实验全部实现了准确判别。由此可见, 这一方法可以应用于临床, 可以在口腔拭子等非常少量 DNA 的基础上, 同时获得多个位点的分型结果, 是一种准确高效的SNP分型方法, 有很好的应用前。(来源:生物通 万纹)

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