作者:贺梨萍 张若婷 来源:澎湃新闻 发布时间:2020/5/6 11:31:58
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《自然》:欧洲根据已知基因序列合成新冠病毒,助力疫苗开发

 

当地时间5月4日,国际顶级学术期刊《自然》(Nature)以“加快评审文章”(Accelerated Article Preview)形式在线发表了来自瑞士、德国、俄罗斯多家科研机构的一项研究“Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform”。团队在已知新冠病毒基因序列的基础上,首次在试验中通过反向遗传学手段在酵母菌中快速构建出了活的新冠病毒。论文中提到,反向遗传学被认为是一种不可或缺的工具,它彻底改变了我们对病毒发病机制和疫苗开发的认识。

论文通讯作者为瑞士伯尔尼大学病毒学与免疫学研究所的Volker Thiel以及该校兽医学院传染病与病理生物学学系的Joerg Jores。该研究工作早在当地时间2月21日在线发表于预印本网站BioRxiv,当时未经同行评议。

值得注意的是,这是一项根据已知病毒基因组进行病毒重建的基础研究工作,该成果与此前的谣言之一“新冠病毒是人工合成的” 无关,本研究中实验室中构建的新冠病毒是在疫情暴发后,根据已经公布的病毒基因组序列进行的病毒重建研究。

研究团队指出,化学合成新冠病毒,尤其在新暴发病毒尚未被成功分离出之前,可以帮助科学家尽快向卫生部门和实验室提供传染性病毒毒株,还可以对单个基因进行遗传修饰和功能表征,从而争取时间对疫情暴发做出快速反应。

大型的RNA病毒基因组,如冠状病毒基因组,由于基因组较大且不稳定,很难在大肠杆菌宿主中克隆和操作。研究团队此次报道了一个基于酵母的合成基因组学平台,用于多种RNA病毒的基因重建,包括冠状病毒科、黄病毒科和副粘病毒科的成员。

研究团队首先在其他RNA病毒(如鼠肝炎病毒MHV)中检验了基于酵母的合成基因组学平台的准确度,团队测试了鼠肝炎病毒A59株中含有绿色荧光蛋白(MHV GFP)的基因克隆能力,结果表明测试的克隆中正确组装了MHV基因组的YAC占90%,这表明病毒在酵母中的组装效率很高。

也正是利用该平台,研究人员在拿到合成DNA片段后一周内,对新冠病毒进行了工程改造和复活。

具体来看,研究团队将病毒基因组分成12个片段,大小在0.5kbp-3.4kbp。同时,为了便于血清学诊断和在细胞培养时追踪,研究团队将合成新冠病毒设计成可以表达GFP(绿色荧光蛋白)。因此,研究团队又将片段11分成3个包含GFP序列的子片段,GFP序列被插入ORF7a(开放阅读框,ORF)中,从而总计有14个片段。

研究团队让试剂公司化学合成上述14个DNA片段,1月14日下订单,2月4日拿到其中的12个片段。片段5和7在大肠杆菌中的克隆出现一些问题未能完成。不过,研究团队恰好同时获得了慕尼黑一位患者的新冠病毒样本(SARS-CoV-2/München1.1/2020/929),他们决定利用RT-PCR扩增获得片段5和片段7。

利用TAR克隆,对于所有6种新冠病毒构建体,研究人员都获得了正确组装的分子克隆。随后,利用转化偶联重组技术 (TAR),用酵母菌的同源重组系统依据末端重复的序列,将这些DNA序列拼到一起。获得完整的病毒序列后,用T7 RNA聚合酶将这一DNA序列转录为病毒RNA,将该RNA用电穿孔技术导入到VeroE6(猴肾细胞)中,使得细胞被感染,培养这些细胞的上清液(含释放出的病毒颗粒)注入到别的培养基中,可以感染别的细胞。

研究团队进而表示,“我们能在获取病毒的合成DNA片段后仅一周的时间内,对最近流行的新冠病毒的化学合成克隆进行工程改造和复活。”病毒的重组有很高的效率和准确度,通常情况下,超过90%的克隆是正确的。

值得注意的是,除新冠病毒外,研究团队还报道了利用该技术合成构建MHV(鼠肝炎病毒,一种冠状病毒)和MERS-Cov等,HCov-229E和Zika病毒的构建仍在实验进行中。

 
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