作者:孙明伟 李寅 高福 来源:生物工程学报 发布时间:2010-6-25 10:19:58
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从人类基因组到人造生命:克雷格·文特尔领路生命科学
 
自人类基因组计划 (Human Genome Project,HGP) 完成以后,生命科学进入“后基因组时代”,生物信息学、计算生物学、系统生物学以及合成生物学等崭新学科不断出现,并得到快速发展。前不久,首个“具有人造DNA的活细胞”在克雷格·文特尔(J. Craig Venter)的研究所横空出世,该成果一经报道立即引起了科学界、哲学界的轰动,合成生物学这一新兴学科也因此再次引起了人们的高度关注。
 
1 2010年夏天的“爆炸”新闻
 
2010年5月20日,J. Craig Venter私立研究所 (J. Craig Venter Institute) 的一个20多人的科研小组在美国Science杂志上报道了首例人造细胞的诞生。这是一个山羊支原体Mycoplasma capricolum细胞,但细胞中的遗传物质却是依照另一个物种即蕈状支原体Mycoplasma mycoides的基因组人工合成而来,产生的人造细胞表现出的是后者的生命特性。这是地球上第一个由人类制造并能够自我复制的新物种。Craig Venter的团队将这一人造细胞称作“Synthia”(意为:合成体)。
 
回顾Venter团队制造人造细胞的研究历程,这项工作早在1995年就开始了。在2007年,Venter团队就已经掌握了在这两种支原体中进行基因组转移的技术,只不过当时的操作对象是蕈状支原体内的天然DNA。2008年2月,Venter团队又成功地合成了另一种原核生物——生殖支原体Mycoplasma genitalium的基因组DNA。今天举世瞩目的人造细胞“Synthia”就是将以上两种技术合而为一的结果。
 
支原体是目前发现的最小、最简单的具有自我繁殖能力的细胞,其基因组也是原核生物中最小的,因此便于操作。尽管Venter团队已经能够合成生殖支原体的基因组,但由于生殖支原体生长极其缓慢,因此研究者选择了生长较快的蕈状支原体和山羊支原体作为实验对象,分以下4个步骤完成实验 (图1)。
 
 
 
图1 文特尔人造生命合成示意图
 
1) 合成供体的基因组DNA:首先,将蕈状支原体的全基因组测序,并按照该序列信息将其合成为1 078条平均长度为1 080 bp的DNA片段。这些片段两两间具有80 bp的部分重叠,所有片段拼接起来构成蕈状支原体的全长基因组。值得注意的是这些合成的片段较天然基因组略有一些改动,包括去除了14个不重要的基因、为阻断基因而设计的两个插入序列、27处单核苷酸多态性 (其中19处在意料之中) 以及4条用来区分于天然序列模本的“水印”标记 (Watermark),这些改动都不影响细胞正常的生命活动。该过程涉及到计算机对合成序列的精密计算。2) 合成DNA片段的拼接:将以上合成的1 078条DNA片段分别连接到载体,使其能在酵母细胞中通过同源重组拼接起来。于是,平均1 080 bp的DNA片段,10个一组拼接为大约10 kb的片段 (109个),然后将这些连接有目的基因片段的载体从酵母中分离出来,转入大肠杆菌E. coli中进行扩增,以限制酶筛选出阳性克隆;之后再将阳性克隆质粒中的这109条10 kb左右的片段按同样的方法每组10个拼接成100 kb的片段 (11个);这11条片段最终拼接成完整的总共1 077 947 bp的基因组 (由于携带太大片段的载体在E. coli中不能稳定传代,因此后两步拼接中采用多重PCR来筛选阳性克隆)。此过程除了2个衔接反应是在体外用酶处理构建,其余所有的片段都是在酵母细胞内依靠同源重组拼接而成。3) 人工基因组的甲基化修饰:由于供体细胞 (蕈状支原体) 和受体细胞 (山羊支原体) 共用同一套限制酶系统,而天然的供体基因组是经甲基化修饰的。因此,拼接完成的基因组DNA还需在体外用甲基化酶 (从蕈状支原体或山羊支原体提取物中纯化) 进行修饰,以避免受体细胞限制酶系统的阻碍。4) 人工基因组移植入受体细胞:将构建好的人工合成基因组移植入山羊支原体内。细胞经过不断分裂传代,具有人造基因组的细胞在含抗生素的培养基中筛选出来,同时含有天然DNA的细胞逐渐消失殆尽。最终只剩下含有山羊支原体细胞质但由合成DNA控制的人工嵌合体细胞。虽然蕈状支原体和山羊支原体在基因组上75%是同源的,但该人造细胞明显表现出蕈状支原体的生长特性。
 
其实,嵌合体细胞应用遗传工程手段早已实现。而Venter的“人造细胞”也只是遗传物质由人工合成,其他组分均来自于已有的生命形式。因此,一些媒体采用“首个人造生命”的说法言之过甚。相反,Venter等人在Science上的文章题目“创造由化学合成基因组控制的细菌细胞”更为严谨、客观。但是无论如何,这项孕育15年、耗资4 000万美元的科技成果,毕竟是生命科学发展的一大进步,在合成生物学发展史上具有里程碑意义。
 
2 Craig Venter挑战人类基因组计划
 
John Craig Venter 出生于1946年,曾应征加入美国海军医疗队参加越战,越南战场的残酷使他认识到时间和生命的宝贵,“人生的每一分钟都应该有所创新”。回国后,Venter仅用了6年时间先后就读于圣马特奥学院 (College of San Mateo) 和加州大学圣迭戈分校 (UC San Diego),并在后者获得了生物化学学士学位和生理学及药理学的博士学位,从此开始了他的学术生涯。
 
2.1 国际人类基因组计划与“霰弹枪测序法”
 
1984年,在一个由美国能源部资助的旨在讨论日益发展的DNA重组技术的会议上,科学家们第一次讨论了人类基因组测序的应用价值。这一年,Venter进入了美国国立卫生研究院 (National Institutes of Health,NIH),从事细胞表面受体研究。在这期间Venter逐渐对基因组研究产生浓厚兴趣。1986年,Nature杂志上报道了Smith等发明的一种DNA序列自动分析技术,Venter立刻与发明人取得联系。几个月后,Venter便拥有了当时NIH的第一台自动基因测序仪。而又是在这一年,诺贝尔奖得主Renato Dulbecco在Science杂志文章中强调人类基因组测序对治愈癌症和肿瘤的巨大作用,同时Robert Sinsheimer等也首次对于人类基因组测序的可行性进行了深刻探讨,使得美国能源部决定对人类基因组启动计划资助530万美元。1988年,诺贝尔生理学或医学奖得主、DNA双螺旋结构的发现者James D. Watson着手领导在NIH成立的美国国家人类基因组研究中心 (National Human Genome Research Institute,NHGRI),Venter便作为其中的一员加入了这项计划。1990年,号称“30亿美元,30亿个碱基对”的人类基因组计划由美国能源部和NIH正式启动,预期15年内完成对人体10万个基因的解码,绘制出人类基因组图谱。之后,英、法、德、日、印等国相继加入,我国也在1999年9月正式加入人类基因组计划并承担1%的测序工作。人类基因组计划成为了一项国际间合作的科研计划。
 

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