■本报记者 李晨

在化学合成的世界里，卤化反应犹如一把精准的手术刀，能够在分子骨架上“安装”卤素原子，从而改变化合物的性质，使其在医药、农药等领域发挥重要作用。

然而，传统化学卤化方法往往伴随着毒性、污染和低选择性等问题。科学家们一直梦想找到一种绿色、高效且精准的替代方案。

近日，杭州师范大学教授郭瑞庭团队与湖北大学团队合作，在《美国化学学会-催化》上以封面文章的形式发表了一项最新研究。他们通过对一种名为AetF的单组分卤化酶进行理性设计，成功实现了色氨酸的“定制式”卤化。

这项成果不仅突破了天然酶的固化模式限制问题，还首次开发出“一锅法”合成混合卤代色氨酸的策略，为绿色生物制造提供了新范式。

从化学卤化到酶催化的转变

“卤化能够在不改变小分子主要架构的情况下，提升其生物活性与稳定性。”论文通讯作者郭瑞庭说。

然而，传统化学卤化方法依赖有毒及腐蚀性气体（如氯气或溴化试剂），不仅对操作人员和环境造成危害，还面临区域选择性差的难题——反应容易产生多种副产物，纯化过程繁琐且效率低下。

因此，科学家们将目光转向了自然界中的卤化酶。这些酶能在温和条件下实现高效、精准的催化，摒除了化学方法的弊端。

“酶催化是一种温和无毒的替代策略，不需要高温高压，反应条件接近生理环境，且能精准控制卤化的位置，减少废物排放。”论文共同通讯作者、杭州师范大学教授陈纯琪告诉《中国科学报》，他们所研究的主角AetF来源于蓝细菌，是一种黄素依赖型卤化酶。

与常见的双组分卤化酶不同，AetF是一种单组分酶，它将卤化酶与还原酶功能集于一身，实现了自给自足。典型的双组分卤化酶需要一个额外的氧化还原伴侣，而AetF自身具有氧化还原的结合域，不需要额外添加还原酶，这大大简化了催化体系，降低了应用成本。

“更值得一提的是，近期研究发现AetF在反应过程中生成的次卤酸不易泄漏，能够更高效地将卤素原子耦合到底物上，这为工业应用提供了显著优势。”陈纯琪说。

然而，天然的AetF存在固有局限。它在催化色氨酸卤化时，会严格遵循“先C5，后C7”的顺序进行连续加工，最终生成5,7-二卤化色氨酸。这种固化模式源于酶的结构特性，其虽然独特，却限制了酶的应用——只能得到双卤化产物，而无法合成单一卤化或混合卤化物，这在药物研发中是一大挑战。

郭瑞庭说，虽然天然AetF不太好用，但由于其不可替代性——单组分色氨酸卤化酶目前只有AetF一个，且其自给自足的特性具有巨大潜力，“所以我们打算通过理性设计，突破天然限制，创造出可定制功能的卤化工具”。

实现“一锅法”绿色合成

在2024年该团队发表的一篇文章中，他们解析了AetF的结构，并观察到S523残基突变为丙氨酸后，酶结合C5卤化色氨酸的能力下降，但保留了对色氨酸C5卤化的活性。

这给了他们灵感——或许通过改造活性口袋，能创造出只对单一位点进行卤化的突变体。

但如何让AetF“听话”地按照人类指令工作？

他们给出的答案是，以高分辨率蛋白质晶体结构为指导，进行精密的酶工程改造。

论文共同第一作者、杭州师范大学副教授黄建文介绍，他们首先解析了AetF与底物（色氨酸或其卤化产物）结合的精细结构，通过X射线衍射技术，直观揭示了底物在活性口袋中的结合模式。

他们发现，S523被替换为丙氨酸后的突变体并不完美。它残留了约3%至4%的C7卤化活性，在长时间反应中仍可能产生副产物。为了彻底消除二次卤化风险，他们展开了“精雕细琢”式的改造。

通过结构分析，他们引入了第二个突变V220I（缬氨酸变为异亮氨酸）和第三个突变L183F（亮氨酸变为苯丙氨酸）。这些突变旨在“重塑”活性口袋，限制了底物翻转后的结合空间。“这个三突变体展现了近乎完美的C5位单卤化活性，杜绝了二次卤化。”论文共同第一作者、湖北大学博士生李豪说。

基于三突变体，他们构思了巧妙的“一锅法”反应方案，中途不用对产物进行纯化，就实现了混合卤化色氨酸的高效合成。该方法能高效生成5-溴-7-碘色氨酸和5-碘-7-溴色氨酸，产率分别高达85%和70%，且产物纯度较高。

“这种方法相比传统分步合成具有显著优势。”陈纯琪解释说，“一锅法”避免了繁琐分离，减少了溶剂和能量消耗，是一种高效的绿色合成策略。

为绿色生物制造提供新范式

这项研究不仅是一项技术突破，更体现了交叉学科合作的科学家精神，发挥了杭州师范大学在结构生物学和湖北大学在酶工程方面的优势。

陈纯琪说：“这项工作首次实现了利用单组分卤化酶体系‘一锅法’合成混合型卤化色氨酸，为复杂卤化分子的绿色生物制造提供了新范式。”这展示了基于结构的理性设计在精准调控酶性能方面的巨大潜力，也为开发绿色、经济的药物中间体合成路线奠定了坚实基础。

郭瑞庭说，这符合“双碳”目标与绿色制造趋势，有望在工业生产中减少化学污染。

未来，团队计划将理性设计策略拓展至其他酶或反应中。郭瑞庭说，这种基于结构的理性设计策略，无疑是酶改造的可靠路径。他们将把这一策略拓展至其他底物，甚至其他酶类的研究中，从而开发更多具有精准调控、区域选择性或立体选择性的生物催化剂。

此外，团队还将融合计算模拟与机器学习，推动“理性设计”到“智能制造”的跨越，以实现复杂分子的绿色、高效、可持续合成。

“酶的结构是我们理解这种天然生物催化剂最直接的手段，也是人为设计和改造的蓝图。这项研究展现了如何通过原子层面的结构信息，理性改造酶的催化行为，从而创造出我们期望的功能。”郭瑞庭团队的工作证明了“用结构设计改变催化世界”的可能性。

论文审稿人也表示，以结构生物学的角度来指导酶学的应用及改造是非常令人信服的。这篇文章将对卤化酶领域及酶理性设计领域作出贡献。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1021/acscatal.5c06868