赵方庆（左二）与团队成员查看测序数据情况。课题组供图

■本报记者 唐凤

实际上，核糖核酸（RNA）不总是“一条线”，这种遗传信息载体也会是一个圈。环形RNA则是一类非常特殊的RNA分子。大量研究表明，它在肿瘤发生和天然免疫过程中发挥着重要的调控作用，但人们一直缺乏对其进行有效测定的手段。

近日，中科院北京生命科学研究院赵方庆团队提出了基于三代纳米孔测序技术对环形RNA全长直接测定的实验和分析流程——CIRI-long。相关论文刊登于《自然—生物技术》。研究人员利用随机引物对环形RNA进行的滚环反转录扩增后，使用纳米孔测序技术对环形RNA的全长序列进行直接测序，并实现了对长测序读段中的环形RNA序列进行识别和全长重构。

中科院上海营养与健康研究所研究员杨力和博士马旭凯认为，该研究为深入探索复杂的环形RNA生成加工奠定了基础。

获得整张图的全貌

环形RNA广泛存在于真核生物中。目前研究表明，在生物体内，环形RNA主要通过其序列特征，发挥miRNA海绵、RBP海绵以及翻译短肽等重要的生物学功能。

由于具有首尾相连的环形结构，环形RNA在细胞中结构更稳定，也存在更强的积累效应。因此，科学家可以利用人工设计的环形RNA分子，在细胞中稳定表达目标蛋白。同时，环形RNA在肿瘤生物标记物和作为治疗靶点等多个方面具有重要的应用前景。

但因为环形RNA序列本身和普通线性RNA高度相似，常用的二代转录组测序技术往往难以获得完整的环形RNA全长序列。

此前，赵方庆团队的研究方向之一就是利用高通量测序技术对环形RNA进行识别。“通过多年研究，我们深切体会到了传统二代测序技术对于环形RNA研究的局限性。”赵方庆告诉《中国科学报》。

随着新一代测序技术的发展，基于纳米孔的长读长测序技术已经在很多领域得到广泛应用。这种测序方法可以一次测定非常长的序列，由此研究人员想到，可否使用该技术研究环形RNA分子结构。

“从测序数据中区分环形RNA和线性RNA，类似于同时拼两幅只有几块不一样的拼图。”论文第一作者张金阳告诉《中国科学报》，“由于两者很相似，只有接头位点具有特异性结构，因此利用短读长测序技术，很难区别这些‘小块’源于线性还是环形分子。利用长读长技术则可以一次获得整张图的全貌，简便地实现对环形RNA序列的直接鉴定。”

效率提高20倍

研究人员通过大量实验，优化了环形RNA的富集方法，利用滚环反转录的方式，获得了含有多个环形RNA全长序列的cDNA片段。他们利用超长读长技术，对环形RNA的全长序列进行了直接测定。研究人员还开发了相应的计算软件，在测序数据中对环形RNA的全长序列进行识别和错误校正。

通过比较，研究人员发现，改进后的方法可以有效富集环形RNA序列，对环形RNA的检测效率提升了近20倍。同时，CIRI-long大幅增强了环形RNA的识别能力，对长度较长的环形RNA也可以进行有效识别。

赵方庆提到，评估显示CIRI-long可靠性高，且可以识别来自线粒体基因组以及转录本通读事件的环形RNA分子，并实现与二代测序相近的分析成本。

近期多个研究也发现，线粒体中可以产生大量环形RNA分子，并且可能具有调节线粒体活性氧输出的重要功能。因此科学家利用CIRI-long方法，可以有效识别这类特殊环形RNA分子，并为其存在提供进一步的证据。

随后，研究人员利用新方法对小鼠大脑组织中的环形RNA进行了深入研究，并发现了一类新型环形RNA分子。这类分子由内含子的全长序列首尾相接组成，具有特殊的剪接信号，可能代表着一种未发现的环形RNA产生途径。

线性、环形RNA有待“一网打尽”

总的来说，该方法建立了针对环形RNA全长的高效识别手段，为环形RNA的功能挖掘提供了重要的研究平台和工具。利用该方法，研究人员可以对环形RNA的全长进行大规模测定，并基于全长序列进行功能预测，也为设计环形RNA治疗靶点提供了重要的研究工具。

复旦大学的张朝以及美国得克萨斯农工大学的韩冷认为，研究结果凸显了该方法在鉴定环形RNA和探索环形RNA形成机制等方面的重要意义。值得注意的是，费城儿童医院的邢毅团队近期开发的isoCirc也实现了基于三代测序对环形RNA全长的高效重构。这些方法提升了环形RNA的检测效率，并能有效重构环形RNA的全长结构，为后续研究环形RNA的功能机制及转化应用等打下了坚实基础。

不过，CIRI-long方法仍有一定局限性。由于环形RNA在生物体内含量很低，在目前研究过程中，研究人员采用多步实验手段针对环形RNA进行富集。因此，该方法只能实现对环形RNA的高灵敏度检测，无法开展对线性RNA和环形RNA的同时研究。因此，未来仍需对环形RNA测序作进一步改进。

接下来，赵方庆团队将继续研究长读长测序技术在环形RNA研究中的应用，结合实验技术与计算方法，对环形RNA的生物学功能和应用进行深入挖掘。

相关论文信息：https://dx.doi.org/10.1038/s41587-021-00842-6