研究背景

精准基因编辑技术为生命科学研究、疾病相关突变修复和作物精准育种提供了重要工具。其中，胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor, CBE）能够在不产生 DNA双链断裂、不依赖供体模板的情况下，实现靶向C-to-T碱基转换，因而在功能基因组学、生物医学和农业育种中具有广泛应用前景。然而，现有CBE工具仍面临两个关键瓶颈：一是传统Cas9对PAM序列具有依赖性，限制了可编辑位点范围；二是多数CBE的编辑窗口较宽，容易造成旁观者编辑，降低产物纯度和应用安全性。尽管缩窄编辑窗口可以提高编辑精度，但往往伴随编辑效率下降，尤其在非经典PAM位点上表现更为明显。

文章概述

近日，南京农业大学作物遗传与种质创新利用全国重点实验室万建民院士和谭俊杰教授团队在Advanced Science 发表题为 “Synergistic HMGN1 and VP64 Fusions Potentiate High-Precision and PAM-Flexible Base Editing” 的研究论文。该研究开发了一类兼具高精度、PAM灵活性和较高编辑效率的新型胞嘧啶碱基编辑系统，为精准单碱基改造提供了新的工具方案。

图文导读

研究团队首先将近乎无PAM限制的Cas9变体SpRY与海七鳃鳗来源胞嘧啶脱氨酶CDA1的C端截短体相结合，构建了一系列高精度SpRY-CBE。结果显示，CDA1截短显著缩窄了编辑窗口，使编辑活性主要集中于PAM上游C-18附近，从而有效降低旁观者编辑。进一步比较不同截短形式后，研究团队确定 CDA1Δ194-SpRY-BE3为综合表现最优的构型。该编辑器在多个非NGG PAM 靶点上均表现出良好的C-to-T编辑能力，并显著提升了目标胞嘧啶相对于旁观者胞嘧啶的编辑选择性。

基于这一高精度编辑特征，团队进一步提出了针对用户指定胞嘧啶的四步设计流程：首先确定目标C；随后将目标C置于编辑器最佳作用位置C-18；再根据下游PAM类型选择合适的Cas9或Cas9变体编辑器；最后选择最优CDA1截短构型进行精准编辑。通过在酵母基因组中随机选择多个含连续胞嘧啶的靶点，研究团队验证了该策略能够有效区分相邻胞嘧啶，并显著提高单一目标C编辑产物的比例。在Can1报告系统的单克隆水平验证中，CDA1截短型SpRY编辑器也明显优于全长CDA1-SpRY-BE3，进一步证明其在复杂胞嘧啶背景下的高精度编辑能力。

尽管SpRY显著拓展了靶向范围，但其在部分PAM类型，尤其是NYN PAM 位点上的编辑效率仍然偏低。为解决这一问题，研究团队系统筛选了15种DNA 互作蛋白，包括转录激活因子、染色质相关因子、先锋转录因子和DNA弯曲蛋白等。筛选结果显示，HMGN1和VP64分别能够在一定程度上提高CDA1Δ194-SpRY-BE3的编辑效率。更重要的是，当HMGN1与VP64以特定顺序共同融合至编辑器N端时，二者产生显著协同增效作用。在36个酵母内源靶点中，HMGN1-VP64-CDA1Δ194-SpRY-BE3相较未融合对照平均提高编辑效率4.24倍，同时保持了以C_-18为中心的窄编辑窗口和较高产物纯度。

研究团队还进一步评估了该增效型编辑系统的多重编辑能力和脱靶风险。在双sgRNA多重编辑实验中，HMGN1-VP64融合编辑器能够同时提高两个靶位点的编辑效率，并明显增加目标C单独编辑产物比例。全基因组测序和转录组水平分析表明，CDA1截短型编辑器相比全长CDA1编辑器显著降低了非特异性 DNA和RNA编辑；HMGN1-VP64融合虽然略微影响部分背景SNV水平，但整体脱靶水平仍显著低于全长CDA1-SpRY-BE3，说明该增效策略在提升编辑效率的同时并未明显牺牲编辑特异性。

为验证该策略在高等植物中的适用性，研究团队将优化后的编辑器改造为 BE4架构，并在水稻细胞中进行测试。结果显示，CDA1Δ194-SpRY-BE4及其 HMGN1-VP64融合版本在20个水稻内源靶点中表现出广泛的编辑活性。其中，Fusion-CDA1Δ194-SpRY-BE4的最高C-to-T编辑效率达到78.57%；相较全长 CDA1-SpRY-BE4，在部分低活性位点上最高相对提升达5938.93倍。此外，在7 个水稻内源非NGG靶点上与植物优化型ePPE进行比较时，Fusion-CDA1Δ194-SpRY-BE4在6个位点上表现出更高的C-to-T编辑效率，平均编辑效率为18.53%，显著高于ePPE的5.31%。这一结果表明，在实现 C-to-T 转换，尤其是在非经典 PAM位点上的高效编辑方面，该系统具有明显优势。

综上，该研究建立了一种高精度、PAM灵活且可通过DNA互作蛋白融合实现效率增强的胞嘧啶碱基编辑平台。通过整合SpRY的广泛靶向能力、CDA1截短体的窄窗口编辑特征以及HMGN1-VP64的协同增效作用，该系统有效缓解了传统CBE在PAM依赖、旁观者编辑和低效率之间的矛盾。该成果不仅为作物精准育种和植物功能基因组学研究提供了新工具，也为开发更高效、更安全的单碱基编辑技术提供了重要思路。

该研究获得江苏省前沿技术研发计划项目（BF2025302）和钟山生物育种实验室项目（ZSBBL-KY2023-04）资助。

图 1｜高精度SpRY-CBE在非NGG PAM靶点上的编辑表现

a，不同CDA1-SpRY碱基编辑器结构示意图。b，CDA1截短型SpRY编辑器在多个非NGG PAM靶点上实现以C-18为中心的窄窗口C-to-T编辑。

图 2｜用户指定胞嘧啶的精准编辑设计与验证

a, 精准编辑流程示意图。b-c, 连续胞嘧啶位点上的精准编辑设计与测试。d, 5组连续胞嘧啶位点上精准编辑表现。 e, Can1报告基因验证单克隆水平编辑精准性。

图 3｜DNA互作元件筛选用于提升高精度SpRY-CBE的编辑效率

a, 融合型编辑器结构示意图。b，候选DNA互作因子分类。c，不同候选因子对编辑效率和编辑窗口的影响，其中HMGN1和VP64表现出较好的增效潜力。

图 4｜HMGN1与VP64协同增强高精度SpRY-CBE的编辑活性

a，HMGN1、VP64及其组合融合编辑器结构示意图。b-d，单因子和双因子融合对多个靶点编辑效率的影响。e–g，HMGN1-VP64融合编辑器在多重编辑中同时提升编辑效率和目标产物比例。

图 5｜增效型高精度SpRY-CBE的脱靶效应分析

a–c，全基因组水平indel和SNV分析。d，转录组水平RNA编辑分析。结果表明，CDA1截短和HMGN1-VP64融合策略在提升效率的同时未显著增加脱靶风险。

图 6｜增效型高精度SpRY-CBE在水稻细胞中的应用

a，水稻细胞中使用的BE4架构编辑器示意图。b，三类编辑器在20个水稻内源靶点上的C-18编辑效率比较。c–d，Fusion-CDA1Δ194-SpRY-BE4与植物优化型ePPE的编辑效率比较。

论文信息

Synergistic HMGN1 and VP64 Fusions Potentiate High-Precision and PAM-Flexible Base Editing

Xi Luo, Yuyao Qu, Zhengyan Ye, Zheng Li, Yuanyan Zhang, Longjiong Luo, Shaokang Li, Wei Zhao, Ming Wang, Ralph Bock, Jianmin Wan, Junjie Tan

Advanced Science

DOI:10.1002/advs.76047

原文链接：

https://doi.org/10.1002/advs.76047

期刊介绍：

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