论文标题：From Random Perturbation to Precise Targeting: A Comprehensive Review of Methods for Studying Gene Function in Monascus Species

论文链接：https://www.mdpi.com/2309-608X/10/12/892

期刊名： Journal of Fungi

期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/jof

研究背景

红曲菌属（Monascus spp.）是一类具备重要生物技术应用价值的丝状真菌，可合成红曲色素、莫纳可啉 K 等多种高活性次级代谢产物，在食品加工与生物医药领域拥有广阔应用前景。另外，有些红曲菌株会产生桔霉素这种真菌毒素，给相关产品代谢潜在的安全风险。因此，解析红曲菌生长发育与次级代谢合成的基因功能与调控机制，对优化菌株发酵工艺、提升功能产物产量与品质具有重要理论与应用价值。作为非模式真菌，红曲菌早期研究主要依托随机插入突变技术开展表型筛选。该 “随机扰动” 研究模式存在筛选工作量大、突变位点解析复杂、无法实现基因定向修饰等缺陷，极大限制了红曲菌基因组序列与生理表型的关联机制解析。因此，实现从随机诱变盲筛到定向精准基因编辑的技术转型，是红曲菌功能基因组研究的关键发展方向。

图1红曲菌属的应用与潜在风险

2024 年，华中农业大学红曲菌研究团队于 Journal of Fungi 发表综述论文 From Random Perturbation to Precise Targeting: A Comprehensive Review of Methods for Studying Gene Function in Monascus Species。该研究系统梳理了红曲菌现有遗传操作技术体系，阐明各类技术的作用原理、优缺点及适用场景，可为红曲菌基因功能解析与分子机制研究提供系统的理论依据与技术参考。。

红曲菌中遗传操作难点

红曲菌独特的生物学特性导致其遗传操作存在诸多技术瓶颈。其一，红曲菌细胞壁结构致密，外源 DNA 穿透难度大、原生质体制备困难，整体遗传转化效率偏低；其二，菌株自身同源重组效率低下，难以高效实现靶标基因的定向替换；其三，可用筛选标记种类有限，多基因编辑与标记回收复用存在技术障碍。此外，红曲菌菌丝多核的生物学特性易诱导嵌合转化子（异核体）形成，大幅增加阳性突变株筛选与纯合验证的难度。上述技术局限，导致早期红曲菌研究以随机诱变为主，难以开展高效、精准的反向遗传学研究。随着基因组测序与生物信息学技术的发展，靶向基因编辑技术逐步成熟，多种适配红曲菌的遗传改造工具被成功构建，为解析其生长发育与次级代谢调控网络提供了重要技术支撑。

红曲菌基因功能研究技术体系：从随机扰动到精准靶向

这篇综述把红曲菌的遗传操作分为“随机扰动技术”和“精准靶向编辑技术”两大板块，系统总结各类方法的原理、应用场景及技术优劣。

随机扰动：随机突变--关联性状与基因

随机诱变属于正向遗传学手段，不预设研究对象，通过制造全基因组范围突变，筛选目标表型，再定位突变位点，适合关联性状与基因，挖掘未知功能的新基因。

(1)粒子轰击（基因枪转化）：红曲菌早期经典遗传转化手段，通过高速粒子将外源 DNA 导入菌丝或孢子，无需制备原生质体；但存在转化效率与同源重组效率双低的缺陷。

(2)农杆菌介导T-DNA 随机插入：红曲菌中应用最广的随机建库手段。农杆菌T-DNA 可随机插入基因组，构建大规模突变体文库。但该技术插入位点随机性强，突变基因定位工作量大，不适用于已知基因的定向功能验证。

图2 根癌农杆菌介导的遗传转化技术（ATMT）在基因编辑中的应用

注：(a) ATMT 基因编辑技术原理；(b) 本团队构建定点基因编辑菌株的人工设计质粒图谱。

精准靶向：基因操纵--解析基因功能

(1)原生质体-PEG 介导转化：制备红曲菌原生质体，利用 PEG 介导外源 DNA 进入细胞，通过同源重组实现基因修饰。该技术操作简便、成本低廉，但原生质体制备受菌株状态与培养条件影响极大，稳定性较差。

(2)农杆菌介导的同源重组：将同源臂序列整合至 Ti 载体，通过农杆菌侵染实现靶基因敲除。相较于 PEG 原生质体法转化效率更高，但受限于红曲菌本底同源重组效率，编辑成功率高度依赖同源臂设计。

(3)CRISPR/Cas系统介导的基因编辑：Cas核酸酶制造DNA双链断裂，极大提升同源重组效率，可以实现基因敲除、定点突变、标记无痕删除。目前该体系在红曲菌中仍存在 Cas 蛋白表达不稳定、gRNA 效率不均、潜在脱靶风险等优化难点。

图3 红曲菌 CRISPR/Cas9 基因编辑系统的质粒构建策略

总结与展望

该综述系统梳理了红曲菌主流遗传操作技术，分析了当前领域存在的技术瓶颈与研究短板，明确了亟待突破的核心难题。文章根据不同研究需求，明确了各类遗传工具的适配场景，为科研人员开展红曲菌基因功能解析、代谢通路挖掘与工程菌株改造提供了可参考的实践路径。

同时，该综述前瞻性展望了领域发展方向，包括开发无痕编辑策略、拓展多元化筛选标记、优化 CRISPR 编辑体系效率等核心研究方向。该综述覆盖基础基因功能研究、代谢机制解析、高产菌株定向改造等多个维度，可为研究红曲菌生命活动的分子机制、菌种精准改造、发酵工艺优化及工业化应用提供坚实的理论与技术支撑。

Journal of Fungi 期刊介绍

主编：David S. Perlin, Hackensack Meridian Health Center for Discovery and Innovation, USA

期刊主题涵盖了病原真菌、医学真菌学、药用真菌、抗真菌药物耐药性、真菌与健康、真菌与皮炎、寄生真菌、真菌分子系统发育、植物真菌和土壤真菌、真菌毒理学、真菌遗传学和进化、真菌生物学、多样性和生态学、真菌和环境互作和真菌应用技术等。目前期刊已被Scopus、SCIE (Web of Science)、PubMed、PMC、CAPlus/SciFinder等数据库收录。