论文标题：Genome-Wide Identification of the U-Box Gene Family and Expression Analysis in Response to Salt Stress in Melon

论文链接：https://www.mdpi.com/2311-7524/12/10/1215

期刊名：Horticulturae

期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/horticulturae

导读

甜瓜（Cucumis melo L.）是葫芦科重要的园艺作物，因其优良的果实品质和较高的经济价值而在世界范围内广泛种植。在我国主要甜瓜产区的设施栽培中，由土壤次生盐渍化引起的盐胁迫日益普遍，严重限制植株生长并影响果实品质，已成为制约产业稳定发展的核心瓶颈。蛋白泛素化是一种重要的翻译后调控机制，可通过调节离子稳态、胁迫信号转导和蛋白质量控制提高植物的耐盐性，其中E3泛素连接酶负责识别靶蛋白、决定底物特异性，而含U-box结构域的PUB蛋白是植物中一类重要的E3泛素连接酶。尽管PUB家族已在多种植物中完成全基因组鉴定，甜瓜中该家族的系统鉴定与功能研究仍十分有限。近期，东北农业大学园艺学院研究团队在Horticulturae 期刊发表研究论文“Genome-Wide Identification of the U-Box Gene Family and Expression Analysis in Response to Salt Stress in Melon”，基于新发布的甜瓜DHL92参考基因组（version 4.0）在全基因组水平系统鉴定了CmPUB基因家族，并整合转录组、qRT-PCR与生理指标分析，揭示了该家族在盐胁迫下的表达特征，为甜瓜耐盐分子育种提供了候选基因资源。

研究过程与结果

作者以甜瓜DHL92参考基因组（version 4.0）为对象，采用同源序列比对（BLASTp）与隐马尔可夫模型筛选（HMM）相结合的方法鉴定CmPUB家族成员：以拟南芥PUB蛋白序列进行BLASTp检索，获得706个候选基因；利用U-box结构域（PF04564）构建隐马尔可夫模型进行HMMER搜索，获得58个候选基因；将两套候选集取交集得到51个候选基因，再经NCBI保守结构域数据库（CDD）验证，剔除1个不含完整U-box结构域的序列，最终获得50个非冗余CmPUB基因，并按染色体位置依次命名为CmPUB01–CmPUB50。50个成员在蛋白序列和理化性质上差异显著：氨基酸数目从CmPUB28的365个到CmPUB13的1488个，预测分子量为34.33–165.58 kDa；不稳定指数介于34.98–58.28，亲水性（GRAVY）从CmPUB14的−0.766到CmPUB11的0.193；亚细胞定位预测显示多数蛋白定位于细胞核、叶绿体和细胞质。

这50个CmPUB基因不均匀地分布在甜瓜的12条染色体上（图1）。其中8号和11号染色体分布的基因最多，分别含6个和7个；2、4、6号染色体各含5个；3、10、12号染色体各含4个；5、7、9号染色体各含3个；1号染色体上仅有CmPUB01。序列特征分析表明，CmPUB蛋白除含有典型的U-box结构域外，还包含ARM重复、WD40重复等辅助调控结构域，可能进一步拓展其底物识别或调控功能；基因结构方面，各成员外显子数目差异较大，从无内含子的紧凑结构到含多个内含子的复杂剪接模式均有分布。

图1. CmPUBs 的染色体定位。标尺表示甜瓜染色体上等长的区段（单位：Mb），从蓝色到橙色的颜色渐变表示基因密度递增（基因数/Mb）。

为解析CmPUB家族的进化关系，作者将50个CmPUB蛋白与拟南芥、黄瓜和番茄的PUB蛋白合并，共229条序列构建系统发育树（图2）。结果显示，CmPUBs可划分为6个亚家族（Group I–VI），其中Group V和Group VI最大，各含13个成员，构成该家族的核心类群，而Group I和Group III分别仅含4个和3个成员。共线性分析发现，甜瓜CmPUB家族内部存在11对共线基因对，表明片段复制是该家族在甜瓜中扩张的主要方式；与拟南芥、黄瓜、番茄、水稻和玉米的比较共线性分析分别鉴定到39、67、40、22和15对共线基因，且随着亲缘关系变远，共线基因对数量呈逐渐下降趋势。启动子分析还发现，CmPUBs启动子区富含光响应元件、激素响应元件（生长素、茉莉酸、水杨酸）以及低温、缺氧、干旱和防御相关的顺式作用元件。

图2. 甜瓜、拟南芥、黄瓜和番茄中PUB蛋白的进化分析。

为明确甜瓜对盐胁迫的响应，作者以耐盐材料M4-116和盐敏感材料M4-75为试验材料，在150 mmol/L NaCl处理下于0、6、12、24和48 h取样。转录组分析显示（图3a），多数CmPUB基因在盐处理后表达发生明显变化，且时间动态差异显著：部分基因在处理早期（6或12 h）即被快速激活，而其他基因则在后期（24或48 h）持续上调，提示CmPUBs可能参与调控盐胁迫响应的不同时间阶段。生理指标测定表明（图3b），叶片是甜瓜响应盐胁迫氧化损伤的主要组织，其SOD、CAT活性和MDA含量的变化幅度明显大于根和茎；与M4-75相比，M4-116在盐胁迫下维持了更高的SOD和CAT活性以及更低的MDA积累，说明其可通过增强抗氧化防御能力减轻盐诱导的氧化损伤。基于转录组筛选结果，研究者选取20个基因进行qRT-PCR验证（图3c），其中CmPUB03、CmPUB25、CmPUB31和CmPUB37在耐盐材料M4-116中处理6 h后即被强烈诱导，而在盐敏感材料M4-75中响应较弱。

图3. 盐胁迫下CmPUBs的表达谱分析及验证。(a) 50个CmPUBs在盐胁迫下的表达热图。红色表示基因表达上调，蓝色表示基因表达下调（NCBI BioProjects PRJNA987131）； (b)SOD活性、CAT活性及MDA含量；(c) 在盐胁迫条件下，M4-116和M4-75中四个CmPUBs的qRT-PCR表达分析。数据以均值±标准差表示（n = 3），不同小写字母表示根据最小显著差异（LSD）检验，各处理组间存在显著差异（p < 0.05）。

研究总结

本研究基于甜瓜DHL92参考基因组（version 4.0）完成了CmPUB基因家族的全基因组系统鉴定，获得50个含完整U-box结构域的基因，并解析了其染色体分布、基因结构、保守基序、系统发育关系、共线性关系以及启动子顺式作用元件特征。表达分析表明，多个CmPUB基因响应盐胁迫，其中CmPUB03、CmPUB25、CmPUB31和CmPUB37在耐盐材料中的诱导强度显著高于盐敏感材料；结合两个材料在抗氧化酶活性和MDA积累上的差异，上述基因可作为甜瓜耐盐相关的重要候选基因。作者同时指出，生理指标主要集中于SOD、CAT和MDA，尚未直接考察ROS积累、Na⁺/K⁺稳态、离子转运、渗透调节和激素信号等耐盐组分与具体CmPUB基因的关系，因此所观察到的转录与生理变化为候选基因优先级排序提供了依据，但尚未建立直接的调控关系。后续研究可借助VIGS、CRISPR/Cas9基因编辑和过表达等技术，结合ROS稳态、离子平衡、蛋白互作及泛素化底物分析，进一步阐明这些基因的分子功能，为甜瓜耐盐分子育种提供支撑。

期刊介绍

主编：Luigi De Bellis, Università del Salento, Italy

期刊重点关注温带到热带园艺的所有领域及相关学科，主题包括果树、蔬菜、花卉、苗圃和风景、以及草药和香料作物等，研究涉及整个园艺供应链。