导读

近日，由伦敦帝国理工学院Simon R. Schultz教授、博士后研究员杨梦柯与中国科学院苏州生物医学工程技术研究所巩岩、唐玉国、贾宏博研究员等牵头，联合广西大学、北京师范大学-IDG/麦戈文脑科学研究院、德国莱布尼茨神经生物所所、慕尼黑工业大学、南京大学等单位提出并构建了新一代双光子显微成像系统ULTRA（Ultra-wide, Layer-penetrating, Two-photon, Responsive Adaptive microscope）。该系统通过自研超大视野物镜与镜筒透镜联合优化设计、实时自适应光学校正以及大面积高性能探测器集成，实现了兼具超大视野、较深成像能力与单细胞分辨率的在体成像。实验表明，ULTRA可在超过50 mm²的超大视野范围内，实现接近900μm的活体脑深层成像，覆盖直径8 mm的空间尺度，并在小鼠脑内完成45.24 mm³范围内的多尺度神经结构和神经元活动观测，为跨脑区、多层级神经环路研究提供了新工具。

研究背景

双光子显微镜因具有较强的组织穿透能力和较高的空间分辨率，已成为活体脑成像和神经环路研究的重要工具。但传统双光子显微镜通常只能在较小视野内观测神经活动，难以同时覆盖多个相距较远的脑区；而一旦尝试扩大视野，又常常受到数值孔径、像差控制、成像深度和荧光收集效率之间固有权衡的限制。因此，如何在同一套系统中同时实现超大视野、单细胞分辨率和深层在体成像，一直是多光子显微技术领域的重要挑战。理解脑功能的关键，在于同时观测大范围神经元群体在不同脑区、不同层次中的活动模式。传统双光子显微镜虽然在局部深层成像方面表现优异，但典型视野通常只有约1 mm量级，难以满足系统神经科学对跨区域、大尺度神经环路同步观测的需求。随着研究问题不断从局部微环路扩展到跨脑区协同活动、脑状态切换和多尺度神经动力学，发展兼具大视野和深层能力的双光子成像系统已经变得越来越迫切。

然而，实现超大视野双光子成像并不容易。首先，受Smith–Helmholtz不变量约束，视野与数值孔径之间存在基本权衡：视野越大，维持高数值孔径越困难，从而影响空间分辨率与荧光收集效率。其次，多光子成像涉及较宽的激发与发射光谱范围，物镜必须在超大视野条件下同时实现良好的色差校正和像差控制，否则视野边缘容易出现明显的场曲、像散和彗差。再者，传统依靠增加镜片数量来校正像差的方法虽有效，却可能带来额外透过损失和自发荧光，不利于深层弱荧光成像。因此，将超大视野、高分辨率和深层成像集成到同一系统中，长期以来一直是技术难点。

研究亮点

为突破传统双光子显微镜在成像尺度上的限制，研究团队提出了ULTRA系统（图1），并围绕“激发端与收集端协同优化”这一思路开展整体设计。其目标不是单纯把视野做大，而是在尽可能扩展成像范围的同时，仍保持足够的空间分辨率、组织穿透能力和信噪比，使其能够真正服务于大尺度、深层、单细胞分辨率的神经科学研究。

图1. ULTRA 系统核心结构。

ULTRA 的核心之一，是研究团队自主设计的 0.5 NA、2 mm工作距离、视野大小直径8 mm的物镜，并将其与管镜作为一个整体进行联合优化。团队通过精确匹配系统的光学展度与中间像面尺寸，在不同镜组之间合理分配屈光度，并在关键位置引入高负屈光度元件，以抑制 Petzval 场曲并改善超大视野边缘成像质量；同时结合特殊色散玻璃，对横向色差、轴向色差及二级光谱进行协同控制，实现复消色差性能。通过这种对物镜和管镜的联合优化，ULTRA 在大视野范围内获得了接近衍射极限的成像质量，并兼顾了双光子激发与单光子激发多色荧光成像的需求（图2）。

图2. ULTRA 系统物镜在双光子和单光子激发下的大视野高分辨率成像。

在超大视野系统中，视野边缘更容易受到残余像差影响，导致激发效率下降、分辨率变差。为此，ULTRA 引入了基于可变形镜的高速自适应光学模块，对视野边缘区域进行实时校正。实验表明，适当的边缘自适应校正能够显著改善视野外围的激发质量，并清晰分辨单个树突棘，说明系统不仅在设计阶段降低了大视野像差，还通过实时校正进一步提升了成像表现。

除了激发端的优化，ULTRA还在荧光收集端进行了关键创新。系统集成了大面积高性能 GaAsP 光电倍增管（PMT），其中有效感光面积达14 mm × 14 mm，最大输出电流范围也从 2 mA 提升至 50 mA。这一设计显著提升了可见荧光的收集能力，减轻了大视野条件下的截光问题，同时显著提升神经活动信号的动态范围，尤其有利于深层功能成像中对瞬变荧光信号的线性记录。

此外，研究团队还针对复杂多光子系统中的飞秒脉冲展宽问题进行了群时延色散（GDD）预补偿，通过荧光强度反馈调节补偿量，在物镜端恢复更窄的脉冲宽度，进一步保证了系统在大视野和深层条件下仍具备较高的双光子激发效率。

在性能表征方面，ULTRA展现出超大视野、单细胞分辨率和较深成像能力并存的特点。系统可在活体脑组织中实现 直径8 mm的成像视野，有效成像面积超过50.27 mm²。更重要的是，它在保持约1 μm量级横向分辨率的同时，将在体成像深度推进到接近900 μm，实现了“看得广、看得深、看得清”的综合性能。

在小鼠的结构成像实验中，ULTRA成功实现了多种小鼠脑组织结构的高分辨观测。系统可在8 mm颅窗下获取超大面积的GABA能中间神经元胞体图像，在超大视野内同时清晰分辨单细胞结构；还能够在活体条件下清楚成像树突与树突棘（图3），并支持连续多天追踪同一树突棘，显示出良好的长期稳定性。此外，研究团队还利用ULTRA开展了大尺度脑血管成像，在跨多个脑区、跨左右半脑的范围内对脑血管形态进行了定量分析。

图3. ULTRA系统对活体小鼠皮层神经结构的成像。

在功能成像方面，ULTRA 同样表现突出。研究团队在基于小鼠的多个成像条件下成功记录了大范围神经元钙活动，在超过7 mm的空间跨度内覆盖浅层到深层皮层区域，并实现了在45.24 mm³脑体积范围内的多尺度神经元活动观测（图4）。系统可在超大视野内同时检测上万神经元活动，并支持跨多个脑区、左右半脑以及深皮层的同步功能成像。相关结果表明，ULTRA不仅能够实现结构上的超大视野观察，还可用于解析大尺度神经网络的动态协同活动（图5）。

图4. ULTRA系统可对运动状态下的小鼠的皮层区域进行超大视野的神经元功能成像。

图5. ULTRA系统可以表征在小鼠运动过程中多个皮层脑区的大规模神经网络活动。

总结与展望

本研究围绕系统神经科学对“大范围、深层、单细胞分辨率”在体成像的迫切需求，提出并构建了ULTRA双光子显微成像平台。该系统通过自研超大视野高数值孔径物镜与管镜联合优化、自适应光学校正、大面积高性能PMT集成以及脉冲色散补偿等多项关键技术，在同一平台上实现了超过50 mm²超大视野、接近900 μm活体深层成像和约1 μm横向分辨率的综合性能。

更重要的是，ULTRA已在多种基于小鼠的在体结构与功能实验中完成验证，既能用于大范围神经元胞体、树突棘和脑血管成像，也能支持跨多个脑区、跨左右半脑以及较深皮层层次的神经元钙活动记录和功能网络分析。这意味着，ULTRA不只是把显微镜的视野做得更大，而是真正为研究脑区间协同编码、感觉-运动整合、认知状态转换以及疾病相关脑网络异常等问题，提供了一个兼具空间尺度、成像深度和细胞分辨率的新平台。随着扫描策略、成像速度和实验范式进一步拓展，ULTRA有望在多尺度神经环路研究和先进生物医学成像仪器发展中发挥更大作用。（来源：LightScienceApplications微信公众号）

相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41377-026-02252-2