论文标题：Resolution of Optimal Mitochondrial and Nuclear DNA Enrichment in Target-Panel Sequencing and Physiological Mitochondrial DNA Copy Number Estimation in Liver Cancer and Non-Liver Cancer Subjects

论文链接： https://www.mdpi.com/2072-6694/16/17/3012

期刊名：Cancers

期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/cancers

作者介绍

通讯作者

Dr. Daniel Wai Hung Ho (何伟雄)

香港大学病理学系助理教授、博士生导师。研究重点是高通量组学数据的生物信息学分析和计算分析工具的开发。尤其关注通过新一代测序、大规模筛查、液体活检以及单细胞和空间转录组学技术对肝细胞癌 (HCC) 进行基因组学研究。同时也参与了多学科综合研究，以探究和理解肝癌发生、转移和治疗反应的分子机制。

文章导读

线粒体是多功能细胞器，其功能对生命至关重要。它们充当合成ATP的动力源，并参与其他涉及炎症、代谢、细胞死亡、细胞转化和细胞命运决定的过程。由基因突变和拷贝数变异引起的线粒体功能缺陷可导致代谢途径功能障碍、氧化还原失衡、避免凋亡和治疗抵抗，导致多种类型的肿瘤发生 (包括肝癌)。

使用循环无细胞DNA (cfDNA) 进行液体活检是一种有效且非侵入性的检测基因组变化的策略。靶组测序侧重于靶向的特定基因组区域，而不是整个基因组，为高测序阅读覆盖率的深入分子分析提供了一种灵活而专注的策略。为了在液体活检中使用靶序列测序来研究线粒体基因组的状态，通常通过从相应的血浆cfDNA中减去外周血单核细胞 (PBMC) 中检测到的突变来检测体细胞突变。然而，线粒体DNA (mtDNA) 拷贝数可能因人类血液中的细胞类型组成而异。更重要的是，mtDNA和核DNA (ncDNA) 通常不以相等的拷贝比存在，差异可能超过100倍。

鉴于mtDNA基因组在肝癌 (HCC) 中的关键作用，HCC患者的靶组测序基因面板设计通常涉及mtDNA和ncDNA探针于组合中。考虑到细胞中mtDNA和ncDNA的基本丰度不相等，这可能导致其DNA的可用性存在显著差异，从而干扰它们在靶富集方面的相对性能，以及它们在基因组表现中存在不良偏差。尤其令人担忧的是，mtDNA基因面板的极高覆盖率可能会反过来降低ncDNA基因面板的覆盖率。因此，研究基因面板中mtDNA和ncDNA探针的最佳合并比例对于靶序列中的靶富集性能至关重要。此外，HCC的病理条件可能会导致mtDNA拷贝数异常，并改变mtDNA和ncDNA含量的差异。

研究过程与结果

在香港大学肝病研究国家重点实验室的这项研究中，研究人员通过在靶组测序基因组DNA (gDNA) 和cfDNA样本中使用一系列不同mtDNA:ncDNA探针稀释比来评估其最佳混合比例。评估主要基于测序读取计数、平均测序深度和目标区域的测序覆盖率。

结果表明，在gDNA和cfDNA样本中，ncDNA的测序数据输出并未受到mtDNA探针稀释度选择的严重影响，而高稀释度则会对mtDNA的测序数据输出产生显著的不利影响。在确定线粒体测序板的性能时，mtDNA探针稀释度越高，测序数据的质量 (包括测序读取计数、平均测序深度和目标区域的覆盖度) 就越差。另一方面，mtDNA探针稀释度越低，测序数据的质量通常符合预期。一般来说，建议mtDNA:ncDNA探针的最佳混合比约为 1:10，以达到在测序性能和成本效益之间实现良好的平衡 (图1)。

图1. 评估mtDNA探针和ncDNA探针不同混合比例的目标区域覆盖率

此外，由于mtDNA的病理变化在人类癌症中很常见，因此研究人员建议系统地估计mtDNA拷贝数相对于ncDNA的正常生理变异范围。分析结果显示在非癌症受试者的cfDNA和gDNA样本中，生理mtDNA:ncDNA拷贝率的中位数分别为38.1和2.9，而在HCC患者中分别为20.0和2.1 (图2)。根据结果估计，与gDNA样本相比，cfDNA样本需要mtDNA:ncDNA拷贝率与估计的正常范围有更大程度的偏差，才能以较高的置信度区分病理状况。

图2. 肝癌和非肝癌患者中mtDNA:ncDNA拷贝数比的调查

研究总结

总之，此研究揭示了mtDNA和ncDNA的靶富集偏差，以及它们对靶组测序性能的影响。此外，实验结果在HCC和非癌症受试者中的发现将为mtDNA和ncDNA之间拷贝数比的病理和非病理变化范围提供有用的参考。这数据还可以为今后癌症线粒体基因组靶组测序研究提供有用的数据基础。

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