论文标题： Pocket Modification of ω-Amine Transaminase AtATA for Overcoming the Trade-Off between Activity and Stability Toward 1-Acetonaphthone

期刊：Engineering

DOI：https://doi.org/10.1016/j.eng.2023.04.009

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氨基转移酶是一种能够催化前手性酮或醛不对称胺化生成相应的手性胺的生物催化剂。然而，活性和稳定性之间的“trade-off”效应限制了其在工业生产中的应用。因此，开发克服这种相互抵消的“trade-off”效应的普适方法以及获得高效催化的氨基转移酶具有重要意义。

浙江科技学院浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室邱帅、黄俊团队与浙大宁波理工学院梅乐和团队合作在中国工程院院刊《Engineering》发表题为“Pocket Modification of ω-Amine Transaminase AtATA for Overcoming the Trade-Off between Activity and Stability Toward 1-Acetonaphthone”（口袋改造策略克服ω-氨基转移酶AtATA对1-乙酰基萘活性和稳定性之间的"trade-off"效应）的研究论文，研究团队针对土曲霉属氨基转移酶（AtATA）的底物结合口袋进行共进化改造，以确定控制AtATA对1-乙酰基萘活性和稳定性的关键氨基酸。通过多轮实验筛选，研究人员发现了一个含四个关键氨基酸位点（R128，V149，L182和L187）的“结构开关”， “最佳”突变体（AtATA_D224K/V149A/L182F/L187F; 命名为M4）。与亲本酶AtATA_D224K（AtATAPa）相比，M4的催化效率（k_cat/K_m^{1-acetonaphthone}，其中kcat是催化活性常数，为10.1 min^-1，K_m^{1-acetonaphthone}是米氏常数，为1.7 mmol·L^-1）和半衰期（t_1/2）分别增加59倍和1.6倍。此外，在50 mL反应体系中，M4催化20 mmol·L-1 1-乙酰基萘，反应10 h后可获得产率为78%的目标产物(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺[(R)-NEA]，对映体纯度达到R > 99.5%。同时，M4还显示出对各种1-乙酰萘酮类似物显著增强的催化活性。通过结构和序列信息分析，进一步发现分子内相互作用的加强以及底物结合口袋和5’-磷酸吡哆醛（PLP）结合口袋之间的角度扩大是AtATA热稳定性和活性同步增强的重要原因。最后，口袋工程策略也将增强的活性和热稳定性成功地转移到其他三个序列相似性介于8%~22%之间的氨基转移酶中。这项研究对于克服ATA活性和热稳定性之间的权衡具有重要意义。

图1. AtATA的三维内部结构图。（a）带有PLP的模型。（b）催化位点几何形状视图。（c）底物结合袋入口处氨基酸残基的放大图。（d）底物结合口袋内氨基酸残基的放大视图。PLP和1-乙酰基萘显示为橙色和紫色棒状。氨基酸残基用红色和蓝色棒状结构表示。（e）突变位点的分布。（f）每个突变体对AtATA-Pa相对活性的影响。所有突变体在40 °C下孵育30 min，检测残留活性。AtATA-Pa的残余活性定义为100%。

关键词

“trade-off”效应，共进化，氨基转移酶，口袋改造

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