作者:冯丽妃 来源:中国科学报 发布时间:2024/3/21 7:32:17
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这个“东方诀窍”,让国产VC逆袭国际市场
——维生素绿色生产法攻关应用纪实

 

■本报记者 冯丽妃

工人接触时间稍长就会头晕乏力、呕吐、白血球下降,严重时甚至昏倒在苯提取平台上,工厂加强局部通风、发放营养菜、定期检查工人白血球的变化仍不能彻底解决安全问题……你可能很难想象,这是上世纪五六十年代我国某药厂生产维生素C(以下简称VC)的场景。

今天,VC每片价格低至几分钱,几乎是每个家庭的药箱中必备的常见药。可回溯到上世纪五六十年代,我国一些药厂的VC生产却曾面临严峻挑战。

为了一劳永逸地解决安全生产问题,中国科学院微生物研究所(以下简称微生物所)的科学家在制药厂里扎了根,用微生物细胞生物氧化代替化学氧化,研发出更加绿色、更低成本的VC人工合成方法——二步发酵法。

这一领跑全球的“东方诀窍”,创下改革开放初期中国最大的民口单项技术出口交易额纪录,使我国VC生产摆脱了困境,为夹缝中求生的中国VC产业成长为国际鳌头打开了一扇大门。

而今天,微生物所科学家开发的另一种维生素家族药物——维生素B5(以下简称VB5)的绿色生产技术,正在引领全球相关产业技术的又一次革新。

1 “大海捞针”觅良种

1969年2月6日,微生物所青年科研骨干尹光琳、徐婉学和徐浩打起背包,匆匆赶往位于北京市朝阳门外的北京制药厂。他们是所里首批下厂、到一线开发VC二步发酵法的科学家。

VC,又称抗坏血酸,是包括人在内的许多动物的必需营养素。历史上,VC长期缺乏引起的疾病曾是困扰世界数百年的谜题。15世纪欧洲大航海时代,它引发的坏血病曾是海员们的噩梦,“出海百人去、返航十人归”的惨剧一直持续到16世纪下半叶。

但直到20世纪二三十年代,科学家才捕获这些疾病背后的“罪魁祸首”。1937年,VC的分离提取获得诺贝尔生理学或医学奖,VC化学构造的揭示和人工合成则分享了同年的诺贝尔化学奖。

基础科学的进步叩开了产业发展的大门。

1933年,瑞士化学家塔德乌什·莱希施特(1950年诺贝尔生理学或医学奖得主)发明了VC的工业生产工艺。瑞士罗氏制药公司采用“莱氏法”一跃成为行业巨头,并占领了全球70%的维生素市场。罗氏还与德国、日本等国的企业组建了“VC联盟”,形成行业垄断。

彼时,VC作为常备药品,应用范围日趋广泛。作为这一产业的“后来者”,1958年,我国东北制药总厂采用莱氏法启动30吨规模VC生产线。此后,上海、北京、南京、石家庄、太原、西安等地的制药厂先后跟进,初步满足国内需求,改变了VC依赖进口的状况。

当然,这一过程并非一帆风顺。当时,北京制药厂的一个生产工艺环节经常发生噬菌体感染,便向微生物所寻求帮助。

微生物所紧密贴合国家需求,彼时课题任务主要瞄准工农业生产需求,在小麦锈病、棉花枯萎病、油菜花叶病、丙酮丁醇发酵、菌类饲料等研究方面做出了一批领先成果。例如,该所向微生物要食物——利用白地霉培养粮食代用品“人造肉”,得到广泛关注。

在帮助药厂培育抗噬菌体生产用菌株的过程中,微生物所科学家薛禹谷和庄增辉发现,不光是噬菌体污染,生产中的化学过程导致的操作环境安全问题也很严重。

如何解决这一问题?有没有替代的方法?

微生物所的科学家第一时间寻找解决方案,徐浩和同事陆德如查阅文献后发现,生物发酵法或是新出路。随后,微生物所迅速与北京制药厂成立协作组,派遣科研人员下厂开展研究。

当时,莱氏法采用一步发酵法加化学方法生产VC,即由葡萄糖加氢生成山梨醇,后者经黑醋菌发酵成为山梨糖,再经化学氧化转化成VC。

协作组所要攻关的技术叫作二步发酵法,其核心在于第二步发酵,即在原有第一步发酵的基础上,用微生物将山梨糖转化成VC前体2-酮基-L-古龙酸(以下简称2-KGA),这样就能用生物氧化技术替代原来的化学氧化法,保障生产安全。

这次协作并没有具体计划,甚至没有设定完成年限。大家只知道,摆在他们面前的是一块“硬骨头”。

莱氏法工艺并不复杂,当时已很成熟,收率比较稳定,成本亦不高。而二步发酵法在世界范围内仍处于实验室研究起步阶段,工业化能不能成功还是未知数。

缺资料、没设备,他们样样都要从零开始。

“就像农民种地要选用优质的种子,让微生物‘干活’首先要选择适合的菌种。”现已退休的微生物所原研究员、时任协作组负责人陶增鑫对《中国科学报》说。

微生物被称为地球生命的“暗物质”,它们无处不在。抓一把土,其中就有几千甚至上万种微生物,至今仍有95%的微生物尚未被认知。如何从海量微生物中找到一株适宜生产的菌种呢?

尹光琳、陶增鑫和微生物所的同事日复一日地坐在操作台前,大海捞针似的对着从各地搜集来的670多个土壤样品,一个个进行微生物分离、培养、突变、发酵、筛选。

尹光琳(左)在实验中。

7个月过去,他们仍一无所获。正当大家快要泄气时,出现了一线希望:一株菌株的发酵液中出现了2-KGA结晶,经检测含有大量的古龙酸。

为了找到一株产酸量较高的菌株,他们前前后后筛选了4500多株能够利用L-山梨糖的细菌,1970年7月,终于从样品中找到一株产酸量较高的优良菌株——N1197A。随后,他们又投入了新一轮的研究中——提高该菌的产酸能力。

有趣的是,陶增鑫和微生物所科学家严自正后来发现,N1197A实际上是一大一小两种菌的自然组合:小菌——氧化葡萄糖酸杆菌菌株发挥产酸作用;大菌——条纹假单胞杆菌菌株虽不产酸,但配合小菌发酵能显著提高其产酸能力。

严自正等研究者鉴定出N1197A为大小菌混合菌株。 图片来源:冯丽妃/摄

回顾VC二步发酵法开发的过程,微生物所所长钱韦介绍,今天工业微生物的育种培养策略已经发生质变。科学家可以利用分子生物学技术,根据研究需要设计改造大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母菌、梭菌等常用“底盘微生物”,使其成为能够“干活”的生产用菌,从而告别了冗长艰苦的菌种分离培养过程。

但是,从提高微生物转化应用的多样性来看,钱韦认为,当前的微生物“底盘”技术思路过于单一,而分离培养微生物、在了解新生命的基础上加以改造,仍是微生物学的核心技术和立学之本。因此,当时的发现对今天的研究仍有重要的启示意义。

2 “晚一步,前面的工夫可能就白费了”

拿到菌种只是第一步,怎样才能提高它的产酸率、将它从试管中稳定放大到工业发酵罐中去?这是等待协作组科学家解答的另一个关键问题。

“跟人一样,细菌种子‘壮’一点,干起活来才有劲。”陶增鑫打了个比方。

要培养出健康的微生物,培养基成分比例、酸碱度高低、灭菌是否彻底……每一步都要把握好“火候”。“假如培养基营养很好,但是高压灭菌不彻底,就会造成‘草盛豆苗稀’;灭菌过头了,培养基营养成分被破坏了,‘种子’吃不好,也没法好好‘干活’。”他说。

为找到适合细菌生长、提高细菌产量的条件,他们需要反复做实验,摸索工艺条件。为加快研究速度,他们先用摇瓶做条件实验,不管工作量多大,都是交叉进行。“一旦有好的结果,我们会立刻将它用到发酵罐上,然后在罐上反复实验,终于使2-KGA产量大幅提高。”严自正回忆说。

严自正在1970年8月接替尹光琳进入协作组。她仍记得用发酵罐做流加实验的最紧张阶段,连续九天每晚只睡两三个小时。流加实验的目的是寻找适宜菌种生长的条件,研究者需要在实验过程中持续添加试剂或调节实验条件,并观察实验结果的变化。只有等一次测定结果出来后,才能确定下一次流加时间和流加量,因此往往要连续工作十几个小时。

“否则,工艺不成熟怎么能够推广给厂家?”陶增鑫说。

回忆起那段夜以继日的紧张工作时光,他直言:“这个研究不仅中国在搞,日本、法国、德国都在搞。在这样的国际赛跑中,如果别人先搞出来,你晚了一步,前面的工夫可能就白费了。”

那时,微生物所的研究人员每星期回家一次,平时和厂里的单身职工一样住集体宿舍,和厂里的职工一起轮班;从打扫卫生、刷瓶子到看发酵罐,样样都干。他们还负责给厂里的技术员讲解微生物发酵原理,反复向年轻的工人师傅强调夜间值守看发酵罐的重要性。

“发酵一罐2-KGA需要四五天时间,水、电、气、培养基等实验成本少则几百元、多则上万元,稍有不慎,就是一大笔损失。”陶增鑫说。

在北京制药厂的支持下,双方相互配合,先后开展摇瓶条件实验近60批、发酵罐和种子罐实验近100批。“厂里保存的原始记录,摞起来有几尺高。”严自正回忆说。

严自正(左)和陶增鑫在工厂做实验。

1971年5月,协作组175升罐实验取得成功,在全行业引发轰动。

同年9月,在山西太原举行的全国维生素丙学大庆经验交流会上,二步发酵法受到极大关注,很多人向协作组寻求菌种。严自正将带去的由N1197A分离纯化后得到的大小菌株,无偿提供给与会者。各地制药厂很快跟进、试行VC二步发酵法。

1972年1月,协作组进一步完成了1750升罐中试,确定了整套工艺路线。严自正坚守到最后一刻,是协作组最后一名回到微生物所的科学家。

仅仅3年,那张没有具体计划、没有具体年限、一切还是未知数的答卷,就有了一个明确可行的答案。

3 蜚声国际 逆袭世界

3年协作实验落幕,VC二步发酵法的火种在国内各地点燃。

东北制药总厂选育出“908”菌种、上海医药工业公司选育出“2980”菌种、太原药厂选育出“152”菌种……后来经验证,这些药厂的主力工作菌种都来自N1197A的小菌。各地制药厂在小试中陆续获得合格的VC成品,菌种产酸总收率超过40%,成本略低于莱氏法。

那么,新工艺能否全面取代旧工艺?1973年5月,原燃料化学工业部(以下简称燃化部)组织全国16家单位,成立上海、北京两个科技会战组,在上海、北京、东北设立3个生产性中试点,对新工艺进行进一步检验、提升。

这次中试证明了二步发酵法菌株的稳定性,3个试点连续投料48批,总收率达45%,成本大幅低于旧工艺。

与莱氏法相较,新工艺最大的优点是安全环保,完全去除了毒性较大的苯、液氯和发烟硫酸,减少了90%的易燃易爆的丙酮。特别是苯的去除,避免了工人中毒的危害,极大改善了劳动条件和生产安全状况。

新工艺还大幅降低了原料成本。按照东北、上海、北京3个厂1973年的总产量570吨计算,可节约化工原料10281吨,化工原料用量仅为旧工艺的59.5%。同时,当时的丙酮原料来自粮食,制取1公斤丙酮需要约4公斤粮食,新工艺可间接节约工业用粮3117吨,相当于6234亩平均亩产1000斤粮食农田的总产量。

关键生物技术的突破和生产优势,让新工艺在全国很快得到推广。

在1974年7月燃化部组织的中试鉴定会上,上海第二制药厂和上海医药工业研究院的参与者笑着对严自正说:“我们吃了个现成饭!”

1976年,上海第二制药厂首先在全国扩建VC二步发酵法生产车间。微生物所协助该厂进一步研究菌种生长规律和发酵条件,在50吨大罐中扩大试验,总收率达47%。

1979年,上海、北京、宜昌等地的制药厂也纷纷投产,发酵率达78%。而当时,国际上日本武田制药厂、瑞士霍夫曼公司的生物发酵研究仍停留在实验室阶段,发酵率在20%上下。

至此,经过10年的持续攻关,中国VC二步发酵法已领跑世界。这10年,微生物所科学家与合作者们的默默坚守,让中国VC生产迈出打破国际垄断、走向国际市场的关键一步。

1980年4月,VC二步发酵法研究获得国家技术发明奖二等奖,奖金5000元。

陶增鑫的国家发明奖获奖证书。

这一技术还蜚声国际。1985年9月12日,中国的VC二步发酵技术以550万美元的价格授权给行业巨头罗氏,创下当年中国最大的民口单项技术出口交易额纪录。在我国改革开放初期以“引进来”为主的阶段,VC二步发酵技术实现了以科技自主创新为支撑的“走出去”。

而且,合同规定,这一“东方诀窍”仅授予罗氏在国际上的生产、使用和销售权,国内公司仍保留制造、使用和销售的权利。这进一步为中国VC走向国际市场打开了一扇大门。

随着国内生产厂家的增加及对二步发酵法的持续改进、发展,我国VC产量不断上升,在国际市场实现了逆袭。

2022年,我国VC产量近11万吨,占全球90%以上,其中9万吨用于出口。华北制药厂、石家庄制药厂、东北制药总厂、江山制药厂等仍在采用二步发酵法生产VC。

每每提起VC二步发酵法,微生物所的科学家都会由衷地感到自豪。

4 接力棒仍在传递

今天,微生物所维生素药物产业链创新的接力棒,仍在传递。针对现代企业生产中的新问题,微生物所新一代的科学家开发出新的绿色生物发酵法,替代行业污染严重的化学法。他们还继承老一辈科学家的精神,把车间当成了家。

当前,全球VB5市场需求每年约两万吨,中国是第一大生产国,产能占全球的80%,但VB5企业经常因高污染被限产或停产。VB5参与脂肪、糖类能量转化,协助中枢神经系统发育,广泛应用于动物饲料和临床治疗。采用化学方法生产VB5已有80多年历史,但需使用甲醛、异丁醛和丙烯腈等易燃易爆原料,且生产过程中会产生剧毒的含氰废水。

过去30多年,荷兰、德国等国企业一直在尝试用生物发酵法取代化学法,但未能突破一个关键技术瓶颈,即具有细胞毒性的副产物杂质含量一直在15%以上的高水平徘徊,严重影响提取收率和生产成本。

反观中国,微生物所研究员温廷益团队对野生大肠杆菌进行了近30轮代谢工程改造,将杂质含量降到2%以下。

凭借明显的技术优势,2022年4月,温廷益团队开发的VB5生物发酵法,以9000万元的价格转让给国内维生素龙头企业黑龙江新和成生物科技有限公司(以下简称新和成)。2023年4月,该企业已建成产量达2500吨的全球首条VB5生物发酵绿色生产线。

新发酵法以源于玉米的葡萄糖为原材料,目前转化率达30%以上,成本低于化学法。“与化学合成法相比,新工艺水消耗减少92%、能耗减少16%,使用可再生资源作为原材料,产品质量优异。”新和成相关负责人表示。

截至2023年10月,半年间,该公司利用生物发酵法生产的VB5已达1500余吨,产品出口北美、东南亚等地区,已占全球VB5销售份额的10%。因为尝到甜头,他们计划下一步将产能扩大到年产8000吨。

“未来,如果把生产中发酵剩余的菌渣做成肥料或类似豆粕的培养基原料综合循环利用,成本会更有优势,而且不会造成环境污染。”温廷益说。

温廷益(前中)、钱韦(后排右二)、刘树文(后排右三)等在合作企业考察指导VB5生产线运行情况。

除署名外,本文图片由微生物所提供

“50多年前,我们的老一辈科学家在落后的条件下,从实际产业需求出发,进驻工厂,做出领先全球的技术,反向输出给西方发达国家。从科技自立自强的角度来讲,这也是今天我们要学习的。”微生物所青年研究组长刘树文感慨道。

为推动产业落地,刘树文在企业菌种验证和中试阶段,把行军床支在车间,值守在发酵罐旁,夜以继日地工作了35天,与企业研发团队解决了一系列技术问题,直到最终实现量产。

“微生物所有一句老同志传下来的话——基础研究是立足之本,应用转化是强所之道。”钱韦说,微生物领域的基础研究、关键技术突破都离不开企业,要始终瞄准国家的重大需求和社会经济发展的要求。

正如半个多世纪前鼓励VC技术落地一样,今天,为鼓励科学家与企业对接,微生物所长期坚持多维评价方式。对于从事工业微生物转移转化的研究人员,不以“论文数量”和“影响因子”论英雄,只要转移转化额度超过200万元,就有资格参评副高级职称;超过3000万元,就可以参评正高级职称。

对于成果转移转化资金的分配,该所毫不含糊:所里留三成,七成由科学家团队自行支配。

这套激励性的制度已经实施了15年,有力促进了一大批前沿技术成果的落地。例如,借助温廷益团队转让的将玉米转化成尼龙的合成生物技术,我国在黑龙江大庆市建成了全球第一条成功运行的万吨级生物基戊二胺生产线,有望打破国外对我国尼龙产业的垄断;研究员陶勇团队研发的唾液酸、海藻糖等系列产品的生物合成技术,在精细化工领域打破国际垄断,使相关产品价格大幅降低……

“现在的科研条件比以前好太多,中国的科研人员肯定能干出更多别人没有做过的事情!”已是耄耋之年的陶增鑫声音洪亮。

回想起VC二步发酵技术走出国门的那一天,88岁的陶增鑫依然记得,协作组喜气洋洋,买了个大西瓜庆祝。那个大西瓜,很甜。

微生物、高科技、大产业——无论时代如何变迁,这都是微生物所的发展愿景,也是微生物所一代代科学家矢志追求的目标。正如钱韦所说,“基础研究成果不但要提炼为高水平研究论文,而且要推动核心生物技术的发展,促进产业升级换代”。

《中国科学报》 (2024-03-21 第4版 专题)
 
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