来源:科学网 发布时间:2022/2/24 15:24:26
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PNAS:PCR检测能力提升一个数量级以上!厦门大学李庆阁团队开发出高阶多重荧光PCR检测技术

 

实时荧光PCR (rtPCR) 是目前应用最广的核酸检测技术,检测模式采用闭管检测,相对于开管检测而言,rtPCR极大降低了扩增产物的污染机会,节省了时间和人力,便于实现自动化,更可以利用阈循环数(Cq值)支持定量检测。然而,rtPCR的一个很大局限在于单个反应所能检测的靶基因数目有限。根据目前主流荧光PCR仪器检测通道数目,单个反应所能检测的靶基因数目很难超过4-6个,限制了该技术在涉及多靶点的复杂疾病上的应用。在PCR反应后添加熔解分析步骤,可在一定程度上增加可检测靶基因数目,但是,伴随荧光探针类型的增加,荧光背景及检测成本也随之升高,尤其是,探针结合区任何核酸变异都可能引起熔点偏移,导致结果误判,使得该法对于靶标数目的提升依然受限。与那些广受瞩目的高通量检测技术相比,已有30年历史的rtPCR似乎正成为一种“低阶”核酸检测技术。

在2022年2月24日在线发表于《美国国家科学院院刊》(PNAS)的一项研究中,厦门大学生命科学学院李庆阁团队报道了一种称为“MeltArray”的荧光PCR新技术,一举将荧光PCR的单管检测能力提高到一个数量级以上,并通过多个临床应用场景,系统展示了该技术强大而灵活的检测能力。

为验证MeltArray的多重检测能力,研究团队首先成功实现了一个20重人类Y染色体无精子因子区域(AZFa、AZFb、AZFc和AZFd)的18个序列标签位点和2个参照基因(SRY基因和ZFX/Y基因)的MelArray检测体系。受该结果鼓舞,研究团队开始挑战更多的靶标数目,成功实现了一个62重用于识别61种O抗原合成基因及1个大肠杆菌管家基因yccT的MeltArray检测体系。上述两个例子均为定性检测,那么,MeltArray可否另外进行定量检测呢?为回答这一问题,研究团队成功实现了一个24重能够同时定性检测19种非定植菌/病毒和1个内控基因,并定量检测4种细菌的MeltArray检测体系。最后,研究团队考察了MeltArray用于突变分析的可行性,成功实现了在单个反应管内一一鉴定出发生在KRAS基因密码子12和密码子13上的9种类型的突变。

MeltArray的以上四个应用场景,实际上对应了分子诊断的三大应用领域,即遗传病、传染病(又分别涉及到病原体鉴定及病原体定性、定量检测这些细分领域)和肿瘤的分子诊断,显示出MeltArray做为通用核酸检测技术的典型特征。当前,实现类似靶标数目的检测均需“开管检测”技术,如芯片、质谱、微球、电泳等,然而这些技术普遍存在设备昂贵,操作复杂、周转时间长等缺点,且国产化率低,在国内外市场上不温不火,长期进展缓慢。相对而言,MeltArray采用广泛可及且已国产化的荧光PCR仪器,具有明显的成本低、操作简便、自动化程度高、周转时间短等诸多优势,结合本文所展现的强大而灵活的技术优势,不仅成功推动荧光PCR这一“老技术”再上“新台阶”,也完美填补了长期存在于低阶PCR和高通量检测二者之间的技术空白!

厦门大学生命科学学院黄秋英助理教授、博士生陈冬梅、杜琛为共同第一作者,生命科学学院李庆阁教授、公共卫生学院廖逸群副教授为共同通讯作者,共同作者包括厦门大学硕士生刘巧巧、林素、梁兰兰、许晔副教授。该研究得到了国家科技重大专项(No. 2017ZX10302301 & No. 2017ZX10303406)、国家自然科学基金(No. 81672110)、福建省社会发展高校产学合作项目(No. 2019Y4002)、厦门市科技计划项目(No. 3502Z201830070 & No. 3502Z20183013)的资助。本文所描述的MeltArray技术已在中国、美国、欧洲、日本、韩国获得专利授权,并向澳大利亚等国递交了专利申请。

李庆阁团队长期从事荧光PCR尤其是多重荧光技术平台研究,2001年报告一种新的寡核苷酸杂交反应模式(Nucleic Acids Research),发明置换探针和置换引物(中、美、日、澳及欧洲专利授权);2004年提出置换探针基因分型技术(Nucleic Acids Research);2006年发明探针编码实时PCR(Clinical Chemistry,中国发明专利授权);2011提出自淬灭探针的多色探针熔解曲线变异分析技术(Journal of Molecular Diagnostics,中、美专利授权),2013年提出基于连接反应的“荧光—熔点”二维标记技术(Nucleic Acids Research, 中、美、欧洲专利授权)。

论文链接:https://www.pnas.org/content/119/9/e2110672119

 
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