论文标题：AlleleAnalyzer: a tool for personalized and allele-specific sgRNA design

期刊：Genome Biology

作者：Kathleen C. Keough, Svetlana Lyalina, Michael P. Olvera, Sean Whalen, Bruce R. Conklin & Katherine S. Pollard

发表时间：2019/08/15

DOI：10.1186/s13059-019-1783-3

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CRISPR基因编辑系统的成功实施依赖于所设计的向导RNA（guide RNA）的高效性(high sensitivity)和特异性(high specificity)。目前领域内研究者开发了若干计算工具用于CRISPR基因编辑系统的向导RNA优化设计，包括优化向导RNA的切割效率以及预测其在全基因组范围内的潜在脱靶位点（off-target sites）。这些计算工具通常会考虑向导RNA与切割位点的碱基匹配情况、DNA序列特征、表观遗传学特征以及基因组染色质开放程度等，并以此作为预测向导RNA切割效率和潜在脱靶位点的重要指标。然而，现有工具在设计过程中一般会使用常用的参考基因组，如人类的参考基因组hg38或小鼠参考基因组GRCm38等。在实际实验以及临床治疗过程中，所使用的细胞系、组织乃至个体化的病人基因组均有可能与参考基因组存在大量的序列差异，如在人类全基因组中，这种差异平均可以达到0.1%【1】。尽管向导RNA通常可以耐受单碱基差异，但这种个体化的序列差异在全基因组内具有一定的可能性会降低向导RNA的切割效率，同时导致不准确的脱靶预测结果。基因编辑系统进入临床的首要考量是安全性，所以我们有必要深入探究个体化基因组差异对于基因编辑系统优化设计的影响，这也是当前精准医学和个体化治疗的一种重要的体现。

近日，美国旧金山Gladstone研究所Katherine S. Pollard教授课题组在Genome Biology 上发表Software类文章AlleleAnalyzer: a tool for personalized and allele-specific sgRNA design【1】，该工作即是对CRISPR基因编辑系统的个性化向导RNA设计的有益探索。需要指出的是，Zhang Feng等于2017年在Nature Medicine发文，通过分析ExAC and 1000 Genomes data，初步探讨了个体化基因组差异对于基因编辑系统的影响；同时，PNAS在同年发表Dana-Farber Cancer Institute的Matthew C. Canver课题组工作，同样指出在CRISPR保真性研究中需要考虑个体化基因组差异对于基因编辑系统可靠性和安全性评估的影响【3】。但是，这两个工作均是通过大规模的个体基因组样本分析说明在基因编辑中考虑个体化基因组差异的重要性，并没有详细探讨如何利用该个体化差异来帮助我们进行基因编辑系统的优化设计。Zhang Feng等的工作中选取了了若干不受个体化差异影响的通用sgRNA (Universal sgRNA)用于实现可靠的基因编辑【3】，是从“求同”的角度来考虑该影响，而AlleleAnalyzer进一步指出如何利用这种个体化的基因组差异来进行个体化的sgRNA设计，体现的是一种“求异”的思想。求同存异相辅相成，可以帮助我们更好的实现个体化和精准化的基因编辑和基因治疗。

通读AlleleAnalyzer全文，我个人比较喜欢的一句话是：“genetic variation is not only a challenge for sgRNA design, but also an opportunity”，这句话是整个AlleleAnalyzer工作的核心，立意拔的高，工作就成功了一半，剩下来的就是围绕这个“opportunity”做文章，如何体现genetic variation是一个opportunity? 如何利用genetic variation来帮助我们进行个体化的sgRNA设计？具体来说，AlleleAnalyzer主要实现以下若干分析和功能：

1. 基于ExAC和1000 genome data对11种Cas变体（具有不同的PAM）的个体化基因组差异对sgRNA设计的影响进行了系统的分析（这一点和Zhang Feng的工作类似，但是涵盖了11种Cas变体，更加全面）。

2. 面向allele-specific editing开发了一个软件工具AlleleAnalyzer，该工具对某些杂合子变异疾病的临床基因编辑和基因治疗具有重要的指导意义。AlleleAnalyzer的想法很直接：既然存在allele-specific variation, 用参考基因组则无法体现这种个体化基因组差异，需要进行allele-specific sgRNA design, 这就是genetic variation带来了的opportunity。AlleleAnalyzer对给定基因的等位基因特异的向导RNA对（pairs of allele specific sgRNA sites）进行识别，同时基于图论的二部图覆盖（set cover）算法（非常经典的图论算法，做生信的还是要学好数学?），利用最少的向导RNA对尽可能覆盖一个群体中最大数量的个体，以获得更为通用的基因治疗潜力。同时，AlleleAnalyzer对预测的sgRNA组合进行进一步的优化以防止产生针对某些特定个体的向导RNA对偏好。

3. 作为一个software类论文，由于AlleleAnalyzer是第一个实现allele-specific editing的sgRNA设计的工具，所以不需要和别的工具比（再次证明做领域内第一个工具而不是跟风的好处?），但是由于基因编辑系统个体化基因组差异影响的思想已经被提出，Reviewer还是要求AlleleAnalyzer重新分析ExAC和1000 Genome data并和Zhang Feng等的工作进行系统的比较。

4. 选取特定细胞系和特定gene, 作为一个案例来说明AlleleAnalyzer进行allele specific sgRNA design的具体流程以及其优势。

5. 同样，作为一个software类论文，需要提供一个真正可用以及易用的工具，该工具已经部署在github上供下载使用，在实现过程中，AlleleAnalyzer整合了CRISPOR【4】的若干功能来帮助其进行脱靶分析。

总结来说，AlleleAnalyzer在个性化基因编辑优化设计方面迈出了有意义的一步。整个工作的想法比较直接，也并非是第一个探索个体化基因组差异对于基因编辑系统影响的工作，但是其在等位基因差异性基因编辑的工具开发这一点上迈出了重要的一步，为CRISPR基因编辑技术应用于个体化基因组分析以及多种基因疾病的治疗（如单倍体剂量不足，基因组印迹以及显性失活等）提供了计算工具层面的有益的支持。相信随着生物信息学者和实验科学家的不断合作和努力，未来可期CRISPR基因编辑系统的可靠性和安全性将获得进一步的提升。

摘要：

The CRISPR/Cas system is a highly specific genome editing tool capable of distinguishing alleles differing by even a single base pair. Target sites might carry genetic variations that are not distinguishable by sgRNA designing tools based on one reference genome. AlleleAnalyzer is an open-source software that incorporates single-nucleotide variants and short insertions and deletions to design sgRNAs for precisely editing 1 or multiple haplotypes of a sequenced genome, currently supporting 11 Cas proteins. It also leverages patterns of shared genetic variation to optimize sgRNA design for different human populations. AlleleAnalyzer is available at https://github.com/keoughkath/AlleleAnalyzer.

（来源：科学网）