作者:李炯等 来源:《分析化学》 发布时间:2012-8-1 10:43:58
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抗甲基化干扰小RNA芯片研究获进展
 
小分子RNA,包括siRNA(small interfering RNA)、miRNA(microRNA)、piRNA(piwi- interacting RNA)等,多次被美国《科学》杂志评为“十大科技突破”和“十大科学进展”,是当前生命科学研究的前沿热点。大量实验证据表明,这些小分子RNA几乎存在于所有的真核生物细胞中,在调控基因表达、细胞周期、生物体发育等方面起重要作用。
 
近年来研究表明,多种小分子RNA都存在3’末端甲基化,如植物中的miRNA、siRNA、hc-siRNA(heterochromatic small interfering RNA)、ta-siRNA(trans-acting siRNA)和nat-siRNA(natural antisense short interfering RNA),昆虫中的siRNA和piRNA,动物中的piRNA。这些小分子RNA的3’末端甲基化可以使其免受细胞中多种核酸外切酶、连接酶、末端转移酶、聚合酶等可作用于核酸3’末端羟基的酶攻击,从而保护小分子RNA的稳定。这些小分子RNA的3’末端甲基化尽管没有改变核苷酸序列,却给现有的高通量检测技术(芯片技术、测序技术)带来了极大的挑战。因现有的商业化高通量检测方法大多基于酶标记或酶连接,这些酶反应都需要与小分子RNA的3’末端发生作用,而3’末端的甲基化会抑制酶反应的效率,最终导致检测结果不准确(芯片方法通常为信号假阴性,测序方法通常无法检测到)。
 
中科院苏州纳米技术与纳米仿生研究所李炯课题组继2011年在Nucleic Acids Research(链接)发表了首次实现常规小分子RNA(无修饰)的高通量非标记芯片方法后,进一步证实该方法也不受小分子RNA的3’末端甲基化影响,可以准确检测上述被修饰的小分子RNA(如图c、d);同时精确定量了商业化芯片中大量使用的Poly(A)聚合酶受3’末端甲基化的影响程度(甲基化小分子RNA的Poly(A)聚合酶反应效率约为常规小分子RNA的1/24,如图a、b)。
 
此外,本非标记芯片检测方法还传承发扬了检测无修饰小分子RNA的优点:1.高效识别小分子RNA末端的单碱基缺失、冗余,以及末端1-3位单碱基的差异,这对常规芯片技术而言难以实现;2.高灵敏度,检测限为20 fM,检测丰度跨4个数量级,满足生物体内绝大多数小分子RNA的检测;3.直接使用总RNA,无需预分离小分子RNA,无需样品标记,大幅度降低了检测的时间和成本。
 
上述的非标记芯片检测方法不仅解决了现有商业化产品检测小分子RNA中遇到的瓶颈问题,为3’末端甲基化的小分子RNA高通量检测提供了理想的解决方案,并且能够推动甲基化小分子RNA的功能研究,为“表观遗传学”和“后基因组”研究发展做出贡献。
 
该工作近期发表于Analytical Chemistry杂志上,得到中科院、国家基金委及江苏省自然科学基金委的大力支持。(来源:中科院苏州纳米技术与纳米仿生研究所)
 
 
 
 
 
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