在化学合成的世界里，卤化反应犹如一把精准的手术刀，能够在分子骨架上“安装”卤素原子，从而改变化合物的性质，使其在医药、农药等领域发挥重要作用。

然而，传统化学卤化方法往往伴随着毒性、污染和低选择性等问题，科学家们一直梦想找到一种绿色、高效且精准的替代方案。

封面论文。郭瑞庭供图

近日，杭州师范大学郭瑞庭教授团队与湖北大学合作，在《美国化学学会—催化》（ACS Catalysis）上以封面论文的形式发表了一项突破性研究，通过对一种名为AetF的单组分卤化酶进行理性设计，成功实现了色氨酸的“定制式”卤化。

这项成果不仅解决了天然酶的固化模式限制，还首次开发出“一锅法”合成混合卤代色氨酸的策略，为绿色生物制造提供了新范式。

从化学卤化到酶催化的转变

卤化在化学与生物合成中扮演着至关重要的角色。有机卤化物广泛存在于药物和农药中，例如，许多抗生素、抗癌药物和除草剂都含有卤素原子。

“卤化能够在不改变小分子主要架构的情况下，提升其生物活性与稳定性。”论文通讯作者郭瑞庭说，卤化可以增强药物分子与靶点之间的相互作用，或延长药物在体内的效期，从而优化药效。

然而，传统化学卤化方法依赖有毒及腐蚀性气体（如氯气或溴化试剂），不仅对操作人员和环境造成危害，还面临区域选择性差的难题——反应容易产生多种副产物，纯化过程繁琐且效率低下。

正因如此，科学家们将目光转向了自然界中的卤化酶，这些酶能在温和条件下实现高效、精准的催化，避免了化学方法的弊端。

“酶催化是一种温和无毒的替代策略，不需要高温高压，反应条件接近生理环境，且能精准控制卤化的位置，减少废物排放。”论文共同通讯作者、杭州师范大学教授陈纯琪告诉《中国科学报》，他们所研究的主角AetF来源于蓝细菌，是一种黄素依赖型卤化酶。

与常见的双组分卤化酶不同，AetF是一种单组分酶，它将卤化酶与还原酶功能集于一身，实现了自给自足。典型的双组分卤化酶需要一个额外的氧化还原伴侣，而AetF自身具有氧化还原的结合域，不需要额外添加还原酶，这大大简化了催化体系，降低了应用成本。

“更值得一提的是，近期研究发现AetF在反应过程中生成的次卤酸不易泄漏，能够更高效地将卤素原子耦合到底物上，这为工业应用提供了显著优势。”陈纯琪说。

然而，天然的AetF存在固有局限。它在催化色氨酸卤化时，会严格遵循“先C5、后C7”的顺序进行连续加工，最终生成5,7-二卤化色氨酸。这种固化模式源于酶的结构特性，其虽然独特，却限制了酶的应用——它只能得到双卤化产物，而无法合成单一卤化或混合卤化物，这在药物研发中是一大挑战。

“因为药物优化往往需要在特定位置引入不同卤素，以精细调控分子性能。”郭瑞庭说，虽然天然AetF不太好用，但由于其不可替代性——单组分色氨酸卤化酶目前只有AetF一个，且其自给自足的特性具有巨大潜力，“所以我们打算通过理性设计，突破天然限制，创造出可定制功能的卤化工具”。

实现“一锅法”绿色合成

“酶的结构是我们理解这种天然生物催化剂最直接的手段，也是人为设计和改造的根本蓝图。”郭瑞庭说，这种以结构为导向的理性设计理念，驱动了整个研究的进程。

在2024年该团队发表的一篇文章中，他们解析了AetF的结构，并观察到S523残基突变为丙氨酸后，酶结合C5卤化色氨酸的能力下降，但保留了对色氨酸C5卤化的活性。

这给了他们灵感——或许通过改造活性口袋，能创造出只对单一位点进行卤化的突变体。

但如何让AetF“听话”地按照人类指令工作？

他们给出的答案是，以高分辨率蛋白质晶体结构为指导，进行精密的酶工程改造。

论文共同第一作者、杭州师范大学副教授黄建文介绍，他们首先解析了AetF与底物（色氨酸或其卤化产物）结合的精细结构，通过X射线衍射技术，直观揭示了底物在活性口袋中的结合模式。

他们发现，S523被替换为丙氨酸后的突变体并不完美。它残留了约3~4%的C7卤化活性，在长时间反应中仍可能产生副产物。为了彻底消除二次卤化风险，他们展开了“精雕细琢”式的改造。

通过结构分析，他们引入了第二个突变V220I（缬氨酸变为异亮氨酸）和第三个突变L183F（亮氨酸变为苯丙氨酸）。这些突变旨在“重塑”活性口袋，限制了底物翻转后的结合空间。“这个三突变体展现了近乎完美的C5位单卤化活性，杜绝了二次卤化。”论文共同第一作者、湖北大学博士生李豪说。

基于三突变体，他们构思了巧妙的“一锅法”反应方案，中途不用对产物进行纯化，就实现了混合卤化色氨酸的高效合成。该方法能高效生成5-溴-7-碘色氨酸和5-碘-7-溴色氨酸，产率分别高达85%和70%，且产物纯度较高。

“这种方法相比传统分步合成具有显著优势。”陈纯琪解释说，传统化学合成需要多步反应、中间体纯化和保护/去保护步骤，耗时耗力且污染大；而“一锅法”避免了繁琐分离，减少了溶剂和能量消耗，是一种高效的绿色合成策略。

“更重要的是，它拓展了有机合成的工具箱。”郭瑞庭说，在药物研发中，引入不同卤素（如溴和碘）能对分子进行精密调控：溴和碘的原子大小、电子效应和代谢稳定性不同，混合使用可优化先导化合物的性能。例如，一个以色氨酸为骨架的药物分子，其C5和C7位可能分别与靶蛋白形成关键作用，通过这种合成体系，能快速构建化合物库，筛选最优候选药物分子。

此外，混合卤化物作为前体，在后续反应中展现出巨大潜力——碘原子反应优先级高于溴，可选择性在碘位点引入新官能团，而不影响溴位点，从而简化合成路线，实现模块化构建复杂分子。

绿色制造新范式启迪未来科研

这项研究不仅是一项技术突破，更体现了交叉学科合作的科学家精神。合作充分发挥了杭州师范大学在结构生物学和湖北大学在酶工程方面的优势。

李豪在酶突变体构建、活性检测和反应优化中发挥了关键作用；黄建文主导了结构解析及机制分析。这种“结构+功能”的研究模式，加速了从酶设计到机制理解的闭环进程。

陈纯琪说：“这项工作首次实现了利用单组分卤化酶体系‘一锅法’合成混合型卤化色氨酸，为复杂卤化分子的绿色生物制造提供了新范式。”这展示了基于结构的理性设计在精准调控酶性能方面的巨大潜力，也为开发绿色、经济的药物中间体合成路线奠定了坚实基础。

郭瑞庭说，这符合“双碳”目标与绿色制造趋势，有望在工业生产中减少化学污染。例如，在制药行业，这种策略可替代高污染工艺，降低废物排放，提升可持续性。

未来，团队计划将理性设计策略拓展至其他酶或反应中。郭瑞庭说，这种基于结构的理性设计策略，无疑是酶改造的可靠路径。他们将把这一策略拓展至其他底物，甚至其它酶类的研究中，从而开发更多具有精准调控、区域选择性或立体选择性的生物催化剂。

此外，团队还将融合计算模拟与机器学习，推动“理性设计”到“智能制造”的跨越，以实现复杂分子的绿色、高效、可持续合成。

“酶的结构是我们理解这种天然生物催化剂最直接的手段，也是人为设计和改造的根本蓝图。这项研究展现了如何通过原子层面的结构信息，理性改造酶的催化行为，从而创造出我们期望的功能。”郭瑞庭团队的工作证明了“用结构设计改变催化世界”的可能性。

而论文审稿人人非常欣赏这篇论文，并表示，以结构生物学的角度来指导酶学的应用及改造是非常令人信服的。这篇文章将对卤化酶领域及酶理性设计领域做出很好的贡献。

相关论文信息：https://doi.org/10.1021/acscatal.5c06868