中国科学院上海药物研究所研究员高召兵领衔的“糖测序联合攻关团队”，联合南京大学教授龙亿涛团队，成功开发了糖苷酶辅助的纳米孔糖测序新策略，首次完成十个连续糖组成单元和糖苷键的准确解析，准确率达98%以上，并提出了“反向测序”原理，基于水解前后电信号的特征性变化进行序列判读和解析。1月2日，相关研究发表于《美国化学会志》。

糖分子在生物体内具有重要的生物学功能，结构复杂性决定了其功能多样性，但当前的糖结构解析技术难以满足高效、精准的糖序列解析要求。纳米孔技术是一种单分子传感技术，具有高灵敏度、高时空分辨率、低成本和便携性等优势，已成功用于核酸测序，且在多肽和蛋白测序中展现巨大潜力。然而，聚糖单元的理化性质与核酸和蛋白相比差异较大，结构更为复杂，采用纳米孔进行糖测序更具挑战性。

基于糖测序联合攻关团队前期设计的α-溶血素突变体M113R/T115A纳米孔作为传感器，攻关团队通过系统优化并提高了糖分子检测的灵敏度和分辨率。团队以链长为十糖的poly-LacNAc为模式糖链，用两种特异性外切糖苷酶组成水解酶体系，将糖苷酶水解反应与纳米孔传感偶联，开展糖链序列信息的解读。该策略无需严格控制易位速率，克服了传统纳米孔链测序应用于糖序列解析中的部分缺陷，显著降低了测序复杂性，同时充分利用了外切糖苷酶的高效性、特异性和纳米孔传感器的灵敏度推导糖序列信息。

进一步地，受物理学中“逆问题”模型的启发，研究团队首次提出“反向测序”原创测序策略，避免了对单糖和复杂糖分子电信号指纹图谱的依赖，因此该测序策略不受当前缺乏高分辨率和全面糖指纹数据库的限制。实验检测和真实场景测试结果提示，该纳米孔检测系统适用于糖水解测序，且即使糖链水解不完全也不影响测序结果。

为提高该糖测序技术的通用性和高效性，实现自动化、无偏和实时检测，团队开发了定制化机器学习算法，并设计了自动化糖测序流程。与薄层色谱检测相比，该纳米孔检测系统的样品检测浓度降低100倍以上，识别时间比质谱和亲水相互作用色谱-高效液相色谱快5倍以上。

研究团队表示，纳米孔技术为糖质密码解析提供了新方法，未来将开发酶阵列系统，以提高该方法的通用性，并将其与自动识别系统集成，降低操作者专业要求。这些进展将促进整个糖科学领域的发展。

糖苷酶辅助的纳米孔糖测序技术。图片来源于《美国化学会志》

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相关论文信息：https://doi.org/10.1021/jacs.4c12940