李劲松：博士，中科院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所研究员，从事体细胞重编程及胚胎干细胞的研究。

 

日前很多媒体报道，日本科学家成功克隆了死亡16年的具有优秀肉质的冠军种公牛“安福号”。值得称道的是，他们是用没有经过任何抗冻处理的冷冻了13年的睾丸组织细胞进行的克隆。

 

“安福号”是日本最著名的HIDA牌牛肉的原始祖先，目前日本68万头黑牛中约有30%与“安福号”有血缘关系。1993年，在“安福号”死后12小时内，它的睾丸在未经任何抗冻处理的情况下被直接冻存在-80℃，10年后又被移入液氮中继续保存了3年。研究人员担心随着时间的推移，优秀的“安福号”的肉质会逐渐丢失，因此，他们开始尝试对“安福号”进行克隆。他们首先将部分冷冻的睾丸组织分离出来在体外进行培养，令人惊奇的是，他们获得了活的细胞并建立了4个细胞系，然后利用这些细胞进行克隆并在过去两年中获得了4头克隆牛，其中有的克隆牛还存活至今。

 

动物克隆技术可以将动物的遗传物质完整地传递下去，这一特点对于那些有价值的动物个体的繁育及保种有着重要的作用。通过传统的有性繁殖的方法获得的第一代个体只能遗传一半的优秀基因，然后通过回交后才能使得在后代的遗传物质中优秀个体来源的基因逐渐占有主导位置，这一过程需要很长时间。然而，通过克隆技术我们可以在一个生育周期内完成优良遗传物质的复制。

 

 

国外报道指出，这是科学界首次复制死亡时间超过10年的牛，而要对死亡超过10年的动物进行克隆，最大的问题是供体细胞的来源。

 

如果已有保存好的来自该动物个体的细胞系，那么直接通过核移植技术就可以重新获得和该个体有着相同遗传物质的克隆个体。然而在“多莉”羊诞生以前，人们并不知道可以通过体细胞核移植技术获得克隆动物，因此，并没有通过细胞培养的方式对一些有价值的动物个体进行种质的保存，死亡的个体通常会被直接冷冻保存。

 

要对这些冷冻保存的个体进行克隆，目前有两种方式，一种是上面提到的从冷冻组织中分离出活的细胞，然后进行克隆，这已被证明是可行的，但是并非所有冷冻的组织或个体中都能分离出活的体细胞，这需要非常严格的保存条件；第二种方法是直接用来自冷冻保存的（已冻死的）组织或个体的细胞进行克隆。

 

2008年，第二种方法在小鼠模型上被证明可行。小鼠皮肤细胞被直接冷冻在-80℃约一年后用于核移植，结果科学家发现其细胞遗传物质及染色体仍然保存完好，能够通过两步法核移植获得克隆小鼠。

 

随后，科学家又进一步证明，来自冷冻了16年的小鼠的体细胞也可以用于克隆，他们从冷冻了16年的小鼠中分离出各种细胞核直接用于核移植，通过两步法获得了克隆小鼠。

 

在这两项研究中，研究人员均未能通过经典的一步法小鼠克隆技术，即将克隆囊胚直接移入代孕母鼠子宫中获得克隆小鼠；而是通过两步法，即先从克隆的囊胚中建立核移植胚胎干细胞系，然后通过四倍胚注射或再次核移植的方法获得克隆小鼠。这一方面说明，来自冷冻个体的细胞的遗传物质及染色体保存得足够好，能够被重编程后形成胚胎干细胞系和克隆动物；另一方面，也可以说明，冷冻对细胞核造成了一些小损伤，导致通过一步法核移植不能获得克隆小鼠。

 

在两步法小鼠核移植程序中，首先要建立小鼠的核移植胚胎干细胞系，胚胎干细胞在体外的培养过程可能为这些小损伤的修复提供了时间，使得这些细胞核能被修复到可用于克隆的程度。因此，需要指出的是，虽然通过上述方法获得的克隆小鼠看上去与正常小鼠无区别，并且能够繁殖后代，但我们还是不能排除在染色体上有着细小的基因序列的变化，而这种变化不会对个体的生长及发育造成致命影响。

 

 

死亡16年的牛已经“复活”，那么复制死亡时间更久远的动物是否可能？电影《侏罗纪公园》里，一只蚊子吸取了恐龙的血液，恰巧又被琥珀完美保存下来，科学家通过基因技术重现了恐龙时代，这给很多科幻迷留下了遐想的空间。

 

目前的种种研究说明，只要核物质保存完整，我们就有可能对已经灭绝的远古动物进行克隆。

 

但要对远古已经灭绝的物种进行克隆，首先要考虑的问题是供核是否能被很好地保存下来。这使得被保存在西伯利亚冻土中的猛犸象成为了科学家最佳的研究目标。

 

不过，要对猛犸象进行克隆，仍然存在非常多的困难。

 

第一个问题是能否获得保存得足够好的核物质用于核移植。虽然去年11月科学家在《自然》上发表了对猛犸象的几乎全基因组的测序结果，但这仍然不足以证明这些经过长期冷冻保存的核物质能够用于核移植。

 

第二是用何种物种的卵母细胞作为核受体进行异种核移植。就人们目前所掌握的知识来看，相隔越近的物种异种克隆成功的可能性越大。而要克隆猛犸象，非洲象似乎是最佳的卵母细胞提供者，但是由于目前克隆的效率非常低，因此需要大量的卵母细胞，这使得克隆的可能性大大地降低。

 

第三个问题是克隆的胚胎移入何种动物的体内进行着床及发育。这需要寻找一个大小合适的相近的物种作为代孕母亲，然而非洲象的个体看上去似乎比猛犸象小了许多。

 

正因为存在这些困难，我们应该采用容易获得的家畜或实验动物的卵母细胞作为受体进行异种核移植，如牛、猪、羊、兔等，首先建立异种重构的囊胚，然后建立异种核移植的胚胎干细胞系。一方面，我们从死的猛犸象组织中获得活的能稳定传代的细胞系，可以为我们以后的实验提供大量的材料；另一方面，通过体外培养的过程，可能会有利于长年冷冻对细胞核所造成的损伤的修复，从而更有利于其用于第二轮的核移植。当然以上的假设也是困难重重，如是否异种重构胚能够在体外发育到囊胚、如何获得异种核移植胚胎干细胞系等。

 

因此，我认为应该利用实验动物作为模型，开展同种和异种核移植研究，探讨体细胞重编程的机理，提高核移植的效率。随着核移植技术的完善及克隆机制的揭示，随着生物技术相关领域，如胚胎干细胞技术、基因重组技术、染色体重构技术等的发展，克隆猛犸象的梦想终将能够实现。

 

《科学时报》 (2009-2-2 A1 要闻)