作者:Fatih Ozsolak 来源:《自然—方法学》 发布时间:2010-8-5 14:06:14
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科学家绘制部分细胞数字基因谱
 
癌症和干细胞生物学的飞速发展凸显出稀有细胞的重要性。尽管新一代测序技术在基因表达研究上无比强大,但它们对如此少量的细胞还是无能为力。到目前为止,很多方法都需要多步样品制备和扩增,这样就有可能引入人为误差,让表达谱不甚准确。于是,我们需要更高保真性的方法。
 
为了绘制极少量细胞的数字基因表达谱,美国Helicos生物科学公司的Fatih Ozsolak和哈佛医学院的David T Ting等扩展了单分子测序(SMS)技术,开发出少量数字基因表达谱(low-quantity digital gene expression, LQ-DGE)的应用。此成果发表在最新一期的《自然—方法学》(Nature Methods)上。
 
利用LQ-DGE,Ozsolak等在无扩增步骤的情况下绘制出低至250个细胞的mRNA图谱。他们修改了Helicos的数字基因表达谱方法,在poly(dT)引物包被的流动槽中捕获poly(A)+的mRNA,并直接在测序仪表面开展cDNA的合成,减少了样品操作,因此提高了灵敏度。
 
为了确定LQ-DGE与标准DGE方法的关系,研究人员比较了4×106个细胞的DGE图谱和1×103个细胞的LQ-DGE表达谱。结果表明两个数据组存在正相关。之后,他们又用LQ-DGE对微量的降解RNA进行图谱分析,发现新鲜样品与FFPE RNA样品的LQ-DGE图像之间存在很强的相关性。
 
为了证明他们的方法适合相关细胞群体的比较,并能回答生物学相关的问题,作者们分析了两个相关但截然不同的细胞类型:SM25和490。SM25来自胰腺上皮内肿瘤病变,KrasG12D突变在胰腺特异表达。而细胞系490是来自恶性胰腺导管腺癌病变。他们鉴定出2000多个差异表达的转录本,并通过qRT-PCR验证了其中一部分,证实了LQ-DGE在鉴定相关细胞的微小差异上的能力。
 
作者认为,与其他低样品量的RNA图谱分析技术不同,LQ-DGE不需要分离RNA或选出mRNA,而是利用高亲和力的RNA-DNA杂交动力学,在流动槽表面直接捕获poly(A)+模板。它也不含片断化或大小选择的步骤,从而将偏向性降至最低,特别是对短的转录本。
 
然而,尽管LQ-DGE是传统数字表达谱的重大改进,但它还不能提供完整的转录组覆盖,因为它只检测约8500个转录本。此外,它是对双链DNA测序,这也有一些问题,比如反转录效率低等。这些问题也在一定程度上限制了LQ-DGE的应用。(来源:生物通 薄荷)
 
 
 
 
 
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