作者:Marc Vidal 来源:《自然—方法学》 发布时间:2011-5-25 15:47:24
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新策略改善蛋白质相互作用分析
 
美国Dana-Farber癌症研究所癌症系统生物学中心(CCSB)的研究人员将PCR拼接与新一代测序结合起来,用于蛋白质的相互作用网络分析。该研究成果近日发表在《自然—方法学》(Nature Methods)在线版上。
 
细胞中存在着成百上千个大分子的相互作用,它们介导的功能维持了正常的细胞活性。为了大规模确定多种生物中的相互作用,人们已经开发出多种高通量的方法,如酵母双杂交系统。然而,目前的高通量蛋白相互作用组(interactome)的数据集质量虽高,但覆盖度很低。对于人类而言,95%以上的相互作用组还有待定位。
 
酵母双杂交系统等高通量定位方法的瓶颈在于确定相互作用的蛋白、DNA或RNA分子的身份。新一代测序技术的补充有望提高通量,同时降低成本。近几年来,新一代测序广泛应用在生物学的多个方面,但尚未应用在蛋白质的相互作用网络定位,因为通过集体测序无法了解每个相互作用对的成员之间的关联。
 
尽管“鸟枪法”测序能够高效测定基因组和转录组,但新一代测序技术无法直接鉴定相互作用对。于是,Dana-Farber癌症研究所Marc Vidal领导的研究小组将PCR拼接(PCR stitching)与新一代测序结合起来,开发出一种大规模并行定位相互作用组的策略(Stitch-seq),并在高通量酵母双杂交系统中检验了这种策略。
 
他们通过PCR将编码相互作用对杂交蛋白的开放阅读框(ORF)或cDNA扩增出来,并通过Sanger或新一代测序来鉴定。X与DNA结合结构域融合(DB-X),Y与激活结构域融合(AD-Y)。当X和Y来源于配对PCR平板的记录位置,它们可通过计算机重组,形成相互作用序列标签(ISTs)。
 
作者提到,他们的策略使整体费用降低了近40%,并允许通量增加。随着新一代测序技术的不断改善,测序费用应当持续下降。作者在研究中选择了454 GS FLX测序平台。之所以选择这个平台,是因为454技术是新一代测序中读长最长的,而82 bp的接头长度要求平均读长要超过100 bp,才能可靠鉴定相互作用序列标签。
 
作者认为,Stitch-seq不仅适用于酵母双杂交系统,还可扩展到其他类型的相互作用分析,改善相互作用组网络定位的能力和范围。(生物通 薄荷)
 
 
 
 
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